Análise exploratória do miRNoma de células-tronco mesenquimais isoladas de fluxo menstrual de mulheres com endometriose

UNIVERSIDADEDESÃOPAULO FACULDADEDEMEDICINADERIBEIRÃOPRETO PROGRAMADEPÓS-GRADUAÇÃOEMGINECOLOGIAEOBSTETRÍCIA AnáliseexploratóriadomiRNomadecélulas-troncomesenquimaisisoladasdefluxomenstrualdemulherescomendometriose ANACLARALAGAZZICRESSONI RibeirãoPreto 2023 ANACLARALAGAZZICRESSONI AnáliseexploratóriadomiRNomadecélulas-troncomesenquimaisisoladasdefluxomenstrualdemulherescomendometriose Versão corrigida.A versão originalencontra-sedisponíveltantonaBibliotecadaUnidadequealojao Programa,quantonaBibliotecaDigitaldeTesese DissertaçõesdaUSP(BDTD). Trabalho de mestradoapresentadoaoProgramadePós-graduaçãoemGinecologiaeObstetríciada Faculdadede MedicinadeRibeirãoPretodaUniversidadedeSãoPaulopara obtençãodo título de MestreemCiências. Área de concentração:GinecologiaeObstetrícia-Opção:BiologiadaReprodução Orientadora:Profª.Drª.JulianaMeolaLovato RibeirãoPreto 2023 Autorizoareproduçãoedivulgaçãototalouparcialdestetrabalho,porqualquermeioconvencionaloueletrônico,parafinsdeestudoepesquisa,desdequecitadaafonte Nome:CRESSONI,AnaClaraLagazzi Título:AnáliseexploratóriadomiRNomadecélulas-troncomesenquimaisisoladasdefluxomenstrualdemulherescomendometriose. DissertaçãoapresentadaaoProgramadePós-GraduaçãoemGinecologiaeObstetríciadaFaculdadedeMedicinadeRibeirãoPretoparaobtençãodotítulodeMestreemCiências. Aprovadoem: BancaExaminadora Profª.Dra.:JulianaMeolaLovato Instituição:FaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto,UniversidadedeSãoPaulo Julgamento:Favorável Prof.Dr.:WillianAbrahamdaSilveira Instituição:SchoolofHealth,ScienceandWellbeing,StaffordshireUniversity Julgamento:Favorável Profª.Drª.:AdrianaL.Invitti Instituição:DepartamentodeGinecologia,UniversidadeFederaldeSãoPaulo Julgamento:Favorável Aosmeuspais,AnaluciaeIvair AoGabriel, ÀminhaavóLúcia, Porseremmeuportoseguro. AGRADECIMENTOS Aosmeuspaisporsempremeapoiaramemtodasasescolhas,alémdoincentivodeseguirmeussonhos.Semoamoreacompreensãodeles,eunãoteriasidocapazdechegartãolonge. AoGabrielpelacompreensãoe todaa ajuda.Vocêfazcomqueeumesintasegura,protegidaeamada. Aosmeusavós,porsempreestarempresentes,meamando,apoiandoe porsempreacreditarememmim,mesmoquandoeunãoacreditava. À Prof.ªDr.ª JulianaMeolae às técnicasde laboratórioCristianae Lilian,quededicaramseutempoeesforçoparaqueessetrabalhofosseconcluído. Aoscompanheirosdejornada,quecontinuemospercorrendooscaminhosdaCiência,apesarde todosos empecilhos.E quesejamoscapazesde nosencorajare demanteramotivaçãoemmomentosdifíceis. ÀCoordenaçãodeAperfeiçoamentodePessoaldeNívelSuperior- Brasil(CAPES)pormeiodoProgramadeExcelênciaAcadêmica(PROEX)peloapoiofinanceiro. AoConselhoNacionaldeDesenvolvimentoCientíficoe Tecnológico(CNPq)peloapoiofinanceiroatravésdoauxílioaprojetosdepesquisa. Ao Programade Pós-Graduaçãoem Ginecologiae Obstetrícia(PPGGO),DepartamentodeGinecologiae Obstetrícia(DGO),daFaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto(FMRP),Universidadede SãoPaulo(USP)e ao InstitutoNacionalde CiênciaeTecnologia(INCT),Hormôniose SaúdedaMulher, porforneceremo suportefinanceiroeestrutural. Àspacientesquedoaramasamostrasepermitiramqueoestudoacontecesse. RESUMOCRESSONI,A.C.L.AnáliseexploratóriadomiRNomadecélulas-troncomesenquimaisisoladasdefluxomenstrualdemulherescomendometriose. 2023.Dissertação(MestradoemCiências)– ProgramadePós-GraduaçãoemGinecologiae Obstetrícia,FaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto,UniversidadedeSãoPaulo,RibeirãoPreto,2023. Umproblemade saúdepública,a endometrioseé umadoençaginecológicabenigna,estrogêniodependentee inflamatóriacrônica,caracterizadapelapresençade tecidoendometrialectópico.Temsidoalvode intensainvestigaçãodevidoa suaetiopatogeniacomplexae multifatorial.Nessecontexto,ateoriadamenstruaçãoretrógradatrazaideiadeque componentesdo fluxomenstrualpodematuarno desenvolvimentodas lesões.Concomitanteao recenteachadode células-troncono sanguemenstrual(MenSCs),oconhecimentosobrealteraçõesde transcritos,a crescenteimportânciade mecanismosregulatóriospós-transcricionaisnadoençae também,a presençadeperfisdeexpressãodemicroRNAsdistintosentretecidosendometrióticose não-endometrióticos,o estudodomiRNomadessascélulaspodeelucidara participaçãodelasno desenvolvimentoemanutençãodaendometriose.NossoachadorecentesobreadesregulaçãodaviacanônicadebiossíntesedemicroRNAsemMenSCsendometrióticasreforçaessahipótese.EssetrabalhotemcomoobjetivocompararoperfildeexpressãodemicroRNAs,atravésdesequenciamentodenovageração,emMenSCsdemulherescomesemendometriose,edestacarviasgênicasreguladaspor eles que podemparticiparda etiopatogeniada endometriose.Estudoscomparativosdessetipo são inéditos.As MenSCsincluídasfazempartede umbiorrepositóriodo setor de ReproduçãoHumanado DGOFMRP-USP. Após osequenciamentoglobalde microRNAs,análisesin silicoforamrealizadasparapredizerexpressãodiferencialeenriquecimentofuncionaldegeneseviasreguladaspelosmicroRNAsdiferencialmenteexpressos.São relatadosnovemiRNAscom expressãodiferencial(hsa-miR-1271-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-337-3p,hsa-miR-1304-3p,hsa-let-7c-5p,hsa-miR-337-5p).TambémidentificamosatravésdeanálisesinsilicoviasegenesreguladosportestesDEmiRsquepossivelmenteestãorelacionadosàmecanismosmolecularesalteradosnaendometriose.Os genesLCOR, PLS3, INO80D, TNRC6BsãoreguladosporpelomenossetedestesmiRNAs,sendotrêsgenesjáestudadosnadoençaeestãoenvolvidoscomviascelularesde:silenciamentopós-transcricionalpor pequenosRNAs,RNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)reguladoresdatraduçãodoPTEN,regulaçãodatraduçãodomRNAdoPTEN, regulaçãoda expressãoe atividadeda RUNX1,senescênciainduzidapor oncogene,regulaçãoda expressãoe atividadede MECP2,regulaçãoda transcriçãoporMECP2,ativaçãode receptoresNMDAe eventospós-sinápticos,long-termdepressione sinapseglutamatérgicaque,quandodesreguladas,podemser cruciaisparaa etiopatogeniadaendometriose.Nossosresultadospodemdirecionara identificaçãode desafioseoportunidadesdepesquisafutura,bemcomocontribuiparaa promoçãodoconhecimentoacercadopapeldascélulas-troncomesenquimaisnaetiopatogeniadaendometriose. Palavras-chave:endometriose;miRNoma;células-troncomesenquimaisdefluxomenstrual. ABSTRACTCRESSONI,A.C.L. Exploratoryanalysisof themiRNomafrommesenchymalstemcellsisolatedfromthemenstrualbloodofwomenwithendometriosis. 2023.Dissertation(MastersDegreeinSciences)––GraduatedPrograminGynecologyandObstetrics,RibeirãoPretoMedicalSchool,UniversityofSãoPaulo,RibeirãoPreto,2023. A public health problem,endometriosisis a benign gynecologicaldisease,estrogen-dependent,andchronicinflammatory, characterizedby thegrowthof ectopicendometrialtissue.Ithasbeenthesubjectofintenseinvestigationduetotheetiopathogenesiscomplexandmultifactorial.Inthiscontext,theretrogrademenstruationtheoryshowsthatcellularcomponentsof menstrualbloodmayact in the developmentof the lesions.Concomitanttotherecentfoundofprogenitorstemcellsinthemenstrualblood(MenSCs),the knowledgeabouttranscriptomicprofilealterations,the crescentimportanceofpost-transcriptionalregulatormoleculesin thedisease,aswellasthepresenceofdistinctmiRNAsprofilebetweenendometrioticandnon-endometriotictissues,themiRNomestudyin thesecellscanelucidatethepossibleparticipationofMenSCsinthedevelopmentandmaintenanceof endometriosis.Ourrecentfindingsof dysregulationof the canonicalmicroRNAsbiogenesispathwayintheendometrioticMenSCsreinforcethishypothesis.Thisworkaimsto comparetheprofileof microRNAsexpressedthroughNextGenerationSequencingin MenSCsof womenwithandwithoutendometriosisandhighlightgenepathwaysregulatedby themthatmayparticipatein theendometriosis’etiopathogenesis.Comparativestudieslikethisareunprecedented.TheMenSCsincludedherearepartofabiorepositoryin thesectionofHumanReproductionfromDGOFMRP-USP. Afterglobalsequencingof microRNAs,in silicoanalyseswereperformedto predictdifferentialexpressionandfunctionalenrichmentof genesandpathwaysregulatedby differentiallyexpressedmicroRNAs.Nine miRNAswith differentialexpressionare reported(hsa-miR-1271-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-337-3p,hsa-miR-1304-3p,hsa-let-7c-5p,hsa-miR-337-5p).We alsoidentifiedthroughinsilicoanalysispathwaysandgenesregulatedbyDEmiRsteststhatarepossiblyrelatedtoalteredmolecularmechanismsinendometriosis.TheLCOR, PLS3, INO80D, andTNRC6BgenesareregulatedbyatleastsevenofthesemiRNAs,threeofwhichhavealreadybeenstudiedin thediseaseandareinvolvedin cellularpathwaysof:post-transcriptionalsilencingby smallRNAs,endogenouscompetingRNAs(ceRNAs)regulatoryPTENtranslation,regulationofPTENmRNAtranslation,regulationofRUNX1expressionand activity, oncogene-inducedsenescence,regulationexpressionandactivityof MECP2,regulationof transcriptionby MECP2,activationof NMDAreceptorsandpostsynapticevents,long-termdepressionandglutamatergicsynapsewhich,whenderegulated,maybecrucialfortheetiopathogenesisofendometriosis.Ourresultscanguidetheidentificationofchallengesandopportunitiesforfutureresearchandpromoteknowledgeabouttheroleofmesenchymalstemcellsintheetiopathogenesisofendometriosis. Keywords:endometriosis,miRNome,menstrualbloodmesenchymalstemcells. LISTADETABELASTabela1:Dadosclínicosdaspacientesincluídasnoestudo.Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022.Tabela2:CaracterizaçãoimunofenotípicaporcitometriadefluxodasMenSCs.Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022.Tabela3: ResumodosdadosgeradospeloMultiQCTabela4:DEmiRsTabela5:RevisãodeliteraturasobreosgenesreguladospelosDEmiRsemendometriose LISTADEFIGURASFigura1:Fluxogramadecoletadasamostras.Fonte:PENARIOLetal.,2022.Figura2: DiferenciaçãocelulardasMenSCsemadipócitose osteócitos.Fonte:(DE OLIVEIRAetal.,2022). Figura3:FluxogramadasMenSCsutilizadasparaavaliaçãodeDEmiRs Figura4:IntegridadedoRNAtotal Figura5:BoxplotsrepresentativosdaexpressãodosDEmiRsemcadagrupo. Figura6:RededeinteraçãomolecularmiRNA-alvogeradapeloCytoscape.A: grausde centralidade6e7.B:Graudecentralidade7. Figura7: ViasenriquecidascomFDR<0,05noWebgestaltparaosgrausdecentralidade 4-7doCytoscape Figura8:BoxplotsepontosrepresentativosdosvaloresdeCtparaomiR-1271-5p. LISTADEABREVIATURASMAISUTILIZADAS eMSCs:células-troncomesenquimaisendometriais EMT:transiçãoepitélio-mesenquimal MenSCs:células-troncomesenquimaisderivadasdofluxomenstrual miRNA:microRNA mRNA:RNAmensageiro MSC:célula-troncomesenquimal DEmiRs:microRNAsdiferencialmenteexpressos SUMÁRIO INTRODUÇÃO 171.MiRNA:estruturaefunção 182.miRNAseoendométrio 193.Endometriose 194.TeoriadaImplantação 205.Células-troncoeTecidoEndometrialEctópico 216.ComponentesdofluxomenstrualeaEndometriose 227.ComponenteGenéticodaEndometriose 238.miRNAseendometriose 239.AchadosanterioresdogrupoemMenSCseHipótese 2410.Justificativa 25OBJETIVOS 28MATERIAISEMÉTODOS 30Aprovaçãoética,locaiseduração 30ParticipanteseCritériosdeElegibilidade 31Figura1:Fluxogramadecoletadasamostras.Fonte:PENARIOLetal.,2022. 32Tabela1:Dadosclínicosdaspacientesincluídasnoestudo.Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022. 32Amostrasarmazenadasnobiorrepositório 33Tabela2:CaracterizaçãoimunofenotípicaporcitometriadefluxodasMenSCs.Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022. 34Figura2:DiferenciaçãocelulardasMenSCsemadipócitoseosteócitos.Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022. 35Isolamento,integridadeequantificaçãodeRNAtotal 35miRNoma 36FunçõesbiológicasdesempenhadaspelosDEmiRs 37ValidaçãoquantitativadomiR-1271-5pporRT-qPCR 38RESULTADOS 40Fluxodetrabalhodoestudo 40Figura3:Fluxogramadoestudo 42Figura4:OseletroferogramasdasamostrasforamobtidoscomaaplicaçãodoAgilent2100BioanalyzereRNA600NanoKit. 43miRNoma 44Tabela3:ResultadosobtidosnoMultiQCparacadaamostrasequenciadaquantoaosmilhõesdeleiturasmapeadas,porcentagemdemapeamentoetotaldesequências44Tabela4:DEmiRs 45Figura5:BoxPlotsrepresentativosdaexpressãodosDEmiRsemcadagrupo. 46FunçõesbiológicasdesempenhadaspelosDEmiRs 47Figura6:RededeinteraçãomolecularmiRNA-alvogeradapeloCytoscape. 48Tabela5:RevisãodeliteraturasobreosgenesreguladospelosDEmiRs(grausdecentralidade6e7)emendometriose 49 Figura7:Viasenriquecidascom265genesnoWebgestaltparaosgrausdecentralidadede4a7determinadosnoCytoscape. 53AvaliaçãodaexpressãodomiR-1271-5pporRT-qPCR 54Figura8:BoxplotsepontosrepresentativosdosvaloresdeCtparaomiR-1271-5p.54DISCUSSÃO 551.Silenciamentopós-transcricionalporpequenosRNAs 562.OsRNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)reguladoresdatraduçãodoPTENeregulaçãodatraduçãodomRNAdoPTEN 573.RegulaçãodaexpressãoeatividadedaRUNX1 584.Senescênciainduzidaporoncogene 595.RegulaçãodaexpressãoeatividadedeMECP2eregulaçãodetranscriçãoporMECP2606.AtivaçãodereceptoresNMDAeeventospós-sinápticos 617.Long-termdepression 618.Sinapseglutamatérgica 62Pontosforteselimitaçõesdoestudo 62CONCLUSÕES 64REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS 66ANEXOSAnexoA-AprovaçãodoComitêdeÉtica 75AnexoB-Artigopublicadorelacionadoàtese 77 INTRODUÇÃO 18 1. MiRNA:estruturaefunção MicroRNAs(miRNAs)são estruturasde fita simples,comcercade 20 a 30nucleotídeos,esãocapazesdereconhecerseusalvosdeRNAmemregiõesconservadas(seedregion)maisfrequentementelocalizadasnasposiçõesde2a7nucleotídeosdaporção5’finaldomiRNA,regiãocrucialparaseudirecionamentoe função(BUSHATI;COHEN,2007;SALIMINEJADetal.,2019). Classicamente,ligam-searegião3’UTR(untranslatedregion)do RNAmensageiro(mRNA),atravésdo emparelhamentode bases,o quecausaumainstabilidadeestruturale promoveo recrutamentode fatoresqueinduzemrepressãotranslacional,deadenilaçãoeconsequentementeodeclíniodomRNA(HA;KIM,2014).AdescobertainicialdopapeldosmiRNAsnaregulaçãogênicaocorreuem1993,comadescobertadogeneLIN-4emnematoides,umgenequecodificaumRNAnãocodificanteemformadegrampodecabelo,com22nucleotídeosequeseligaesuprimeatraduçãodomRNAdeLIN14(LEE;FEINBAUM;AMBROS,1993). Em2000,estenovomecanismoderegulaçãogênicafoiconfirmadocoma descobertadequeostranscritosdelet-7têmpapelsemelhantenocontrolepós-transcricionalemnematoides(REINHARTetal.,2000). Desdeentão,mais de 2500miRNAsforamidentificados(KOZOMARA;BIRGAOANU;GRIFFITHS-JONES,2019)e estudadosemumaamplagamadeorganismos,e tornou-seevidentequeessasestruturase suasfunçõessãoaltamenteconservadasemorganismosdistantementerelacionados(HAetal.,2008).Estãoassociadosa uma amplavariedadede processosbiológicos,desdeodesenvolvimentoembrionário(GROSS;KROPP;KHATIB,2017)atéadiferenciaçãocelular(POSNER;LAUBENBACHER,2019), reparoteciduale regeneração(SEN;GHATAK,2015), metabolismo(HARTIGet al.,2015)e, respostaimune(LU;LISTON,2009). OsmiRNAsdesempenhamum papelprimordialna regulaçãoda expressãogênica,desencadeandoalteraçõesnoperfilproteico(BAEKetal.,2008), vistoque,o aumentodaexpressãodeummiRNAlevaà repressãodatraduçãodomRNAalvo,emcontrapartida,aregulaçãonegativadomiRNAexerceoefeitooposto,oqueafetanumerosasviasmolecularesecausaalteraçõescelulareseteciduais(CATALANOTTO;COGONI;ZARDO,2016;YING;CHANG;LIN,2008). Dessaforma,os efeitoscombinadosde váriosmiRNAspodeminfluenciarasaúdeeadoença(OSMAN,2012;SANTAMARIA;TAYLOR,2014). 19 2. miRNAseoendométrio UmdostecidosprecisamentereguladopormiRNAsé o endométrio,quepassapormudançasestruturaise funcionaisaolongodosciclosmenstruais,sobcontrolemolecularrigorosode estímuloshormonais(TAMARUet al.,2020). A interaçãofuncionalentremicroRNAsehormôniossexuaisnoendométrioébidirecional.Duranteafaseproliferativa,oestrogênioinibemiRNAssupressoresde tumore induzos oncogênicos,possivelmenteatravésda regulaçãoda maquinariadebiossíntese(COCHRANE;CITTELLY; RICHER,2011; KLINGE,2012).Emcontrapartida,os miRNAssãoresponsáveisporregularaexpressãodosreceptoresnuclearesER α e ER β e PR-Ae PR-B.Ademais,miRNAsestãopresentesno fluidoluminaluterino,sugerindoparticipaçãotambémno processodeimplantaçãoedesenvolvimentodoembrião(KOLANSKAetal.,2021).Dessaforma,é esperadoqueempatologiasendometriaishajadesregulaçõesdemiRNAse seusalvos,sendoobservadoemfalhasrecorrentesdeimplantaçãodeembriões(KOLANSKAet al., 2021;SANTAMARIA;TAYLOR,2014), câncerendometrial(KOLANSKAet al.,2021;LAFERLITA et al.,2018;SANTAMARIA;TAYLOR,2014;TAMARUetal.,2020), leiomiomas(SANTAMARIA;TAYLOR,2014), gravidezectópica(TAMARUet al.,2020), endometritecrônica(LAFERLITAetal.,2018)e endometriose(KOLANSKAet al.,2021;LAFERLITAetal.,2018;OHLSSONTEAGUEetal.,2009;SANTAMARIA;TAYLOR,2014;TAMARUetal.,2020). Sendoaúltimaobjetodeestudodessetrabalho. 3. Endometriose Endometrioseé umdistúrbioginecológicobenigno,caracterizadopelapresençaecrescimentode tecidoendometrialectópico,temnaturezamultissistêmica,é inflamatóriocrônicoe estrogêniodependente(ZONDERVAN;BECKER;MISSMER,2020). Oquadroclínicoé heterogêneo,ossinaisclínicosmaisfrequentesassociadosàcondiçãoincluemdorpélvicacrônica,dismenorreia,dispareunia,problemasgastrointestinaise/ou urináriosrelacionadosà menstruaçãoe infertilidade(KUZNETSOVet al.,2017). Osprocessosendócrinos,imunológicos,pró-inflamatóriose pró-angiogênicosenvolvidosnodesenvolvimentoda endometriosesão multifatoriaise sua causaaindanão estácompletamentecompreendida(WANG;NICHOLES;SHIH,2020).Suaetiopatogeniapermaneceindeterminada,comdiversasteoriaselaboradasparaexplicá-la,incluindoa implantação(SAMPSON,1940), metaplasiacelômica 20 (GRUENWALD,1942), indução(LEVANDER;NORMANN,1955)e disseminaçãolinfo-vascular(JERMAN;HEY-CUNNINGHAM,2015). E apesarde muitas,nenhumadessasprerrogativassozinhassãocapazesdeexplicarporqualrazãoadoençaseorigina.É provavelmenteo resultadoda combinaçãode váriosprocessosbiológicosaberrantes,que incluem:1) menstruaçãoretrógrada,disseminaçãolinfovasculare/oumetaplasiaem mulherescomfunçãoimuneprejudicada;2) célulascommecanismosmolecularesanômalosquecompõemo endométrioeutópicoe ectópico;3)predisposiçãogenéticae/ouepigenéticaparao desenvolvimentodeimplantesectópicos;4)apresençadecélulasprogenitorasalteradasorigináriasdoendométrioe descamadasnofluxomenstrualatuandono desenvolvimentoe manutençãodaslesõesectópicas;e 5)ummicroambienteperitonealreceptivo,hormonal,inflamatórioepró-oxidante(LAGANÀetal.,2019).Tendoporbaseestasinformações,adotamosnestetrabalhocincopremissas:1ª) ateoriadaimplantação(SAMPSON,1927); 2ª)a presençadecélulas-tronconoendométrio(eMSC)e nofluxomenstrual(MenSCs)comopossíveisiniciadorasdotecidoendometrialectópico(BOZORGMEHRetal.,2020;GARGETT, 2007;GARGETT; MASUDA,2010;GARGETT; SCHWAB;DEANE,2015); 3ª) associaçãoentrecomponentesdo fluxomenstruale o estabelecimentoda endometriose(BRENNERet al., 2002;CRONAGUTERSTAMetal.,2021;DASILVAetal.,2014;KUANetal.,2021); 4ª)endometrioseéuma doençacom forte componentegenético (GOULIELMOSet al., 2020;KRISHNAMOORTHY; DECHERNEY, 2017; VASSILOPOULOUet al., 2019;ZUBRZYCKAetal.,2020); 5ª)miRNAscomoagentesfisiopatológicosnadoença(AZAMet al., 2022;BARANOV; MALYSHEVA; YARMOLINSKAYA, 2018;BJORKMAN;TAYLOR,2019; KLEMMT; STARZINSKI-POWITZ,2018;NASUet al., 2022;NOTHNICK,2017). 4. TeoriadaImplantação Aexplicaçãomaisaceitaparaamaioriadoscasosdeendometriosepélvicaéateoriadaimplantação(VINATIERetal.,2001). Acredita-sequepequenosfragmentosdecélulasendometriaisviáveissãotransportadosparaa cavidadepélvicaduranteo fluxomenstrualretrógrado,umadescobertafeitapor Sampsonem 1927apósobservaçõesclínicaseanatômicas(SAMPSON,1927). Essascélulasretêma habilidadedeadesãoe invasãoaoperitônio,podemmultiplicare sediferenciar, originandoassimlesõesformadasportecidoendometrialfuncional(BURNEY;GIUDICE,2012;WANG;NICHOLES;SHIH,2020). 21 Contudo,esta teoriatem umacontradiçãoimportante,queé a ocorrênciademenstruaçãoretrógradaem90%dasmulheresemidadereprodutiva(HALMEetal.,1984),masapenas10%delasdesenvolveadoença. 5. Células-troncoeTecidoEndometrialEctópico Umahipóteserecentepropõequeascélulas-troncoendometriaisdesempenhampapelfundamentalna etiopatogeniadaendometriose(LIUet al.,2020a;MARUYAMA,2022).Devidoà naturezaaltamenteregenerativadoendométrio,foipropostopor a existênciadecélulascomaltacapacidadeclonogênica,semelhantesacélulas-troncomesenquimais(MSC),noendométrio(eMSCs- endometrialmesenchymalstemcells) (PRIANISHNIKOV, 1978).Devidoàscélulasprogenitorasadultasestabeleceremahomeostasetecidual,espera-sequeofuncionamentoinadequadode eMSCspossaestarrelacionadoao inícioe progressãodeafecçõesginecológicasrelacionadasao crescimentoendometrialanormal,comoaendometriose(CHAN;SCHWAB;GARGETT, 2004;GARGETT, 2007).Umateoriaquantoa etiopatogeniamaiscontemporâneacorrelacionaessascélulascoma etiopatogeniada endometriose(LIUet al.,2020).A presençade células-troncomesenquimaisendometriaisnofluxomenstrual(MenSCs)(MENGetal.,2007)eemlesõesendometrióticas(CHANetal.,2011;KAOetal,2011)jáforamevidenciadas,sugerindoqueessascélulaspodemser um fatorcríticono estabelecimentoe progressãodaslesões(GARGETTeMASUDA,2010;GARGETTetal.,2016).Atéo momento,asatençõestêmsidomaisdirecionadasparaeMSCs(BARRAGANetal.,2016;LIUetal.,2020b;REKKERetal.,2017;SPITZERetal.,2012)doqueàquelaspresentesnofluxomenstrual(MenSCs)(HWANGetal.,2013;WARRENetal.,2018,p.20).Demodogeral,édescritoqueeMSCssãoprecursorasdefibroblastosdoestromaendometrial(BARRAGANet al., 2016)e quehá diferençassutisna expressãogênicaentreasendometrióticaseascontrolesenvolvidoscom:controlededegradaçãoproteica,inibiçãodeviabilidadecelular, formaçãodecolôniaseproliferaçãocelular(BARRAGANetal.,2016),maiorcapacidadeproliferativae invasivae maiorexpressãodemarcadoresinflamatórios,comociclooxigenase-2(COX-2),(IFN)-γ,interleucina(IL)-10(NIKOOet al.,2014).Característicasquepodemsersuavizadascomo tempode exposiçãoà culturacelular,conformeobservadopelonossogrupo(CRESSONIetal.,2023;DEOLIVEIRAetal.,2022;PENARIOLetal.,2022). Tomadasemconjuntotaisalterações,acredita-sequeasMenSCssãoprogramadasgeneticamenteparadarorigemàslesõesectópicas,alémdesofreremos 22 possíveisimpactosdeletériosdo fluidoperitonealde mulherescom endometriose(BRAZA-BOÏLSetal.,2013;CAPOBIANCOetal.,2017;COSÍNetal.,2010;MALVEZZIetal.,2019). 6. ComponentesdofluxomenstrualeaEndometriose Amenstruaçãoéumprocessofisiológicointricadoqueaindapossuimuitasquestõesnão solucionadas(KUANet al., 2021). Para entenderos possíveismecanismosetiopatogênicosdo microambienteendometrialna endometriose,a avaliaçãodo efluentemenstrualéumaalternativanãoinvasivaemcontraposiçãoàbiópsiaendometrial.Emumestudomaisrecente,emvoluntáriassaudáveisoperfildecitocinasnoplasmasanguíneomenstrualfoideterminadoeevidenciadoumperfildiferentedosanguemenstrualquandocomparadoao plasmasanguíneoperiférico.Altasconcentraçõesde C5/C5a(componente5 e 5a do complementohumano),IL-6,IL-1 β e CXCL8(C-X-CMotifChemokineLigand8 (IL-8))foramdetectadas,enquantobaixasconcentraçõesde IL-2,IL-12p70,XCL1/Linfotactinae interferon- γ foramencontradas(CRONAGUTERSTAMetal.,2021).Tendoemvistaesseambienteendometrialinflamatórioemcondiçõesfisiológicas,espera-sequenacondiçãoendometrioseissosejaexacerbado,conformedescritoemumarevisãorecentedaliteratura,queumadesregulaçãonosanguemenstrualpodecontribuirparaapatogênesedaendometriose(KUANetal.,2021). Dentreasalteraçõesmencionadasestão:mediadoresinflamatórios,metaloproteinasesda matrizendometrial,estressehipóxico,balançoentreapoptosee proliferaçãocelular, quepodemprolongara sobrevivênciadedetritosendometriaisna cavidadeperitoneale promovera migraçãoe invasãodotecidoadjacente.Alémdisso,foramreportadasaltasconcentraçõesdemetaloproteinasesdamatrizedofatordecrescimentoendotelialvascular(VEGF)nosanguemenstrual,alémdevariaçõesem quimiocinas,citocinase reguladorescelulares,comoNF κ B, prostaglandinas,interleucina-8(IL-8),ciclooxigenase-2(COX-2)e peptídeoquimiotáticode monócitos-1(MCP-1)no ambienteperivascular, que podemfacilitara invasãode leucócitosnoendométrio(BRENNERetal.,2002). Ainda,aatividadeinflamatórialocalalteramarcadoresdeinflamaçãoeangiogênesenosanguemenstrualdemulherescontrolesecomendometriose,eacentuaasatividadesdemacrófagoseleucócitosdaspacientesacometidaspeladoença(DASILVAetal.,2014). 23 7. ComponenteGenéticodaEndometriose Endometrioseé umacondiçãohereditáriaafetadapormúltiplosfatoresgenéticos,epigenéticose ambientais(KRISHNAMOORTHY; DECHERNEY, 2017). Estudosfamiliares,análisesdeligação,estudosdeassociaçãogenéticae fenotípicacomoo GWAS(GenomeWideAssociationStudies)ajudarama esclarecerparcialmenteafisiopatologiadadoença,coma identificaçãodelocigenéticossignificativosemtodoo genoma,comoos10q26e 20p13,queafetamo riscodedesenvolvimentodeendometrioseefornecemnovosinsightssobreos mecanismosenvolvidosna doença(VASSILOPOULOUet al.,2019;ZUBRZYCKAetal.,2020). AaplicaçãodeGWASpodeserútilparadiversasfinalidades,desdea identificaçãoda causada doençae esclarecimentode suapatogênese,até adescobertadenovossubtipose previsãodoriscodedesenvolvimentodadoença,alémdeproporcionara identificaçãode variantesmenoscomunscom efeitossignificativos(VASSILOPOULOUetal.,2019).Algumasdas causasgenéticasda endometriosejá foramidentificadas,comoaidentificaçãodegenescandidatos,comoCYP2C19, INHBA, SFRP4, e HOXA10envolvidoscommodulaçãoanormalda progressãodo ciclocelular, apoptose,adesão,angiogênese,proliferação,processosimunológicoseinflamatórios,respostaàhipóxia,viaesteroidogênicaesinalizaçãohormonal,alémdaidentificaçãodepolimorfismosdenucleotídeoúnico(SNPs)(ZUBRZYCKAetal.,2020). 8. miRNAseendometriose Naúltimadécada,onúmerodepublicaçõescorrelacionandomiRNAsàendometriose(BRAZA-BOÏLSetal.,2014;CHEGINI,2012;HAWKINSetal.,2011;SAAREetal.,2017;SANTAMARIA;TAYLOR,2014)e a outrasdoençasdo sistemareprodutorfemininoaumentoude formasignificativa,e foi demonstradoquemiRNAse seusalvosestãodesreguladosnestasdoenças(BJORKMAN;TAYLOR,2019;NOTHNICK,2017;PINGMUetal.,2016).Emumaanáliseintegradado transcriptoma-miRnomadoendométrioeutópicodemulherescome semendometriose,foramidentificadasasfamíliasdemiRNAsmiR-9emiR-34comodesreguladas,queemanálisesdeenriquecimentomostram-serelacionadasaprocessosbiológicosdemortecelular, ciclocelularemontagemeorganizaçãocelular, viascanônicasdemecanismosmolecularesdecâncere regulaçãodociclocelular(BURNEYetal.,2009). Bemcomoemamostraspareadasde endométrioectópicoe eutópico,foram 24 detectados84 miRNAscomexpressãodiferencialsignificativa,dentreelesmiR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-182e miR-202tiveramaexpressãovalidadaporRT-qPCReosalvosmolecularesforampreditospor ferramentasin silico, e enriqueceramfunçõesenvolvidasna endometriose,comoexpressãogênica,crescimentoe proliferaçãocelular,desenvolvimentocelular, movimentocelular, mortecelular, ciclocelular, cânceredistúrbiosdo sistemareprodutivo(FILIGHEDDUet al.,2010). Posteriormente,foramrevelados10microRNAsreguladospositivamentee 12microRNAsreguladosnegativamentea partirdaintegraçãotranscriptoma-miRnomadeamostraspareadasdeendometriomase endométrioeutópico.Análisesin silicopredisseramos alvosdessesmicroRNAse, o miR-29ctevevalidaçãofuncionalemfibroblastosdoestromaendometrialhumano,associando-seagenesdamatrizextracelular(HAWKINSetal.,2011). EssesachadosdemiRNAsdiferencialmenteexpressossãoconvergentesparaaassociaçãocomviasdeproliferaçãocelular,mortecelular,ciclocelularemecanismosmolecularesdecâncer, quepodemfavorecerodesenvolvimentoeaprogressãodadoença.Dessaforma,miRNAsparecemter papelna fisiopatologiada endometriose(BARANOV; MALYSHEVA; YARMOLINSKAYA, 2018; KLEMMT;STARZINSKI-POWITZ,2018;NASUet al.,2022), evidenciadoporperfisdistintosdemiRNAs(BRAZA-BOÏLSetal.,2013;BURNEYetal.,2009;FILIGHEDDUetal.,2010;HAWKINSetal.,2011;MASHAYEKHIetal.,2019;SAAREetal.,2014,2017)emRNA(CHENet al.,2022;PENARIOLet al.,2022;REKKERetal.,2017,2018)emamostrasendometrióticasesaudáveis,bemcomopeladiscrepâncianaexpressãodetranscritosesuasrespectivasproteínasemamostrasendometrióticas(FASSBENDERet al.,2010,2012;PRAŠNIKARetal.,2020;QIetal.,2020;WREN;WU;GUO,2007).Tendoem vistaa importânciadosmecanismosregulatóriosdosmiRNAsparadiversosaspectosdaendometriose,bemcomoarelaçãoentreendometrioseeoscomponentesdofluxomenstrual,é possívelqueosmiRNAstenhamtambémimportanteparticipaçãoemviasgênicasalteradasnasMenSCsdaendometriose. 9. AchadosanterioresdogrupoemMenSCseHipótese Nossogrupotem buscadopor alteraçõesmolecularesem diferentespaisagensbiológicasômicasem células-progenitorasdescamadasno sanguemenstrual,e quepossivelmenteestãorelacionadasao desenvolvimentoda endometriose.Algumasdasalteraçõesencontradasforama superexpressãodo miR-200b-3pquepodedesencadear 25 aumentodeproliferaçãocelular, conservaçãodestemnesseacentuadoprocessodetransiçãomesenquimal-epitelialno endométrioeutópicode mulherescom endometriose(DEOLIVEIRAetal.,2022). Tambémevidenciamosumadiminuiçãodeduasvezesnaexpressãode DROSHA, enzimachavena biossíntesede miRNAs,e sugerimosa identificaçãonaendometriosedediferentesperfisdemiRNAscoma biogênesedependentedeDROSHA(CRESSONIet al.,2023). Ademais,apresentamosumperfiltranscriptômicoe proteômicoalteradonasMenSCsdaendometrioserelacionadoàviasgênicasalteradas(sinalizaçãoPI3KviaAKTparamTORC1,sinalizaçãomTORC1,sinalizaçãoTGFbeta,sinalizaçãoTNFAviaNFkB,sinalizaçãoIL6STAT3e respostaà hipóxiaviaalvosHIF1A)provavelmentecomoconsequênciadomicroambienteendometrialinflamatóriocrônicocaracterísticodadoença(PENARIOLetal.,2022).Portanto,pondera-seque o fluxomenstrualretrógradoconduzMenSCscomalteraçõesprimáriasnaexpressãodemiRNAsparaacavidadepélvica,quepodemparticipardodesenvolvimento,estabelecimentoemanutençãodelesõesendometrióticas.Dessaforma,a investigaçãode mecanismosque esclareçama expressãoe a funçãode miRNAsrelacionadosàfisiopatologiadaendometrioseeopossívelpapeldasMenSCsnadoençaédeextremaimportânciaparao entendimentoda etiopatogeniacomplexae multifatorialdaendometriose,alémdepermitira identificaçãodealvosmolecularesparaumdiagnósticomenosinvasivooucomaplicaçõesterapêuticasalavancandooconhecimentodadoença. 10.Justificativa A endometrioseé consideradaumproblemadesaúdepúblicae suaetiopatogeniaaindaécontroversaeobscura.Indíciossobreaexistênciadecélulas-tronconoendométrioeno fluxomenstrualjá estãoevidenciadosna literatura,como:a presençadepopulaçõescelularesABCG2+localizadasexclusivamentenoendotéliodascamadasbasale funcional(MASUDAet al.,2010;TSUJIet al.,2008); a capacidadedediferenciaçãodascélulasendometriaisSidePopulationemepiteliaiseestromaisinvivoe invitro(KATOetal.,2007;MASUDAetal.,2010); umnúmerorelativamentepequenodecélulasendometriaishumanasdispersas,principalmenteda camadafuncional,capazesde gerartecidoendometrialcompostode glândulas,estroma,célulasimunese componentesvascularesquandotransplantadassobcápsularenaldecamundongosimunodeficientes(MASUDAetal.,2007);e células-troncomesenquimaisexpressaremMCAMe PDGF-Rßemregiõesperivascularesdascamadasfuncionalebasaldoendométriohumano(SCHWAB;GARGETT, 2007). Estes 26 achadoslevantamahipóteseparaumapossívelorigemdotecidoendometrialectópicoeumnovo mecanismona etiopatogeniada endometrioserelacionadaà participaçãodecélulas-tronconestecontexto.Emvirtudede as célulasprogenitorasadultasregularema homeostasetecidual,espera-sequeo funcionamentoanormaldaseMSCse MenSCspossaestarenvolvidonoinícioe progressãode doençasginecológicasrelacionadasà proliferaçãoendometrialanormal,comoéocasodaendometriose(GARGETT;CHAN,2006;GARGETT, 2007).Sabe-sequeexistediscordânciaentreosníveisdeexpressãodetranscritoseosníveisproteicos,processoquetemsidoassociadocomodesenvolvimentodeendometriose(WREN;WU;GUO,2007). Aindanãohá na literaturadadossobrerastreamentodemiRNAnasMenSCs,e destaformaé desconhecidose umadesregulaçãopós-transcricionalpoderiaexplicaros mecanismosda associaçãodas MenSCsao processoetiopatogênicodaendometriose.Osendométrioseutópicoe ectópicodemulherescomendometriosecompartilhamalteraçõesquenãosãoencontradasnoendométriodemulheressemendometriose,o quecorroboracoma ideiadequeesteendométrioalterado,aocairnacavidadeperitoneal,teriapotencialinicialparadesenvolvera doença(SHARPE-TIMMS,2001). Nossosachadospréviossugeremqueas células-progenitorasdescamadasno fluxomenstrualcarregamalteraçõesprimárias,algumasdas quais podemser explicadaspor desregulaçãopós-transcricionalpormiRNAs(CRESSONIet al.,2023;DEOLIVEIRAet al.,2022;PENARIOLetal.,2022).Esforçosdedicadosàprocurademecanismosparaesclareceraexpressãoefunçãodegenesrelacionadosà fisiopatologiadaendometriosepermitemidentificarnovosmarcadoresmolecularesparaumdiagnósticomenosinvasivooucompossíveisaplicaçõesterapêuticas,sendode sumaimportânciaparacompreensãodestacomplexadoença.A tecnologiadesequenciamentohigh-throughputforneceumapoderosaferramentaparaa análisedotranscriptomae trazvantagenssobremétodosconvencionaisde rastreamento,comoosmicroarrays.Asmetodologiasdesequenciamentoparaquantificarníveisdiferencialmenteexpressosde transcritostêm custosreduzidos,maiorespectrodos transcritose,consequentemente,aumentadacapacidadededetectartranscritosraros,isoformasrarasdesplicingalternativo,no-codingsequencese quantificaçãodireta(dadosdecontagem)daabundânciada transcriçãoapresentando-secomovantajosaemrelaçãoaosmicroarrays(MOROZOVA;HIRST;MARRA,2009;TARIQetal.,2011). 27 Assim,acreditamosqueasMenSCsdemulherescomendometriosequedescamamdurantea menstruaçãoe caemna cavidadeperitoneal(susceptível),devidoao fluxomenstrualretrógrado,possuemumperfildemiRNAsalterado. 28 OBJETIVOS 29 1. Compararo perfilde expressãode miRNAsde MenSCsobtidasde mulheressaudáveiscomasdeendometriose;2. Buscarpor processosbiológicosou viasgênicasenriquecidaspelosmiRNAsdiferencialmenteexpressos(DEmiRs)que têm funçõesrelacionadascom aetiopatogeniadaendometriose 30 MATERIAISEMÉTODOS 31 Aprovaçãoética,locaiseduração Local.A expansãodas célulasfoi realizadano Centrode TerapiaCelularnoHemocentrodeRibeirãoPretodaUSP. A extraçãodoRNAe asprimeirasavaliaçõesdequalidadedaamostraforamrealizadasnoLaboratórioMultiusuáriodoDGO-FMRP/USP. Aconstruçãode bibliotecasde RNAspequenose a execuçãodo sequenciamentoforamrealizadasemumprestadorde serviçosde NGScomexpertiseemprotocolosIlluminamiRNA-Seq.Aprovaçãoética.EssetrabalhofoiaprovadopelocomitêdeéticadoHospitaldasClínicasdaFaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto(HCRPnº3644/2019).AsMenSCsutilizadasnesteestudoforamcoletadas,isoladase caracterizadasdenovembrode2014adezembrode2016(HCRPnº15227/2012)eatualmentefazempartedeumbiorrepositóriodaSeçãodeReproduçãoHumanadoDepartamentodeGinecologiae Obstetrícia(aprovaçãoéticanúmeroHCRP3644/2019).Oconsentimentolivreeesclarecidofoiobtidodetodasasparticipantesenvolvidas.Duração.Esteestudocaso-controleestásendorealizadodesdeabrilde2021. ParticipanteseCritériosdeElegibilidade O fluxogramaderecrutamentodaspacientes(figura1)e a caracterizaçãoclínica(tabela1)foramapresentadasanteriormentepelonossogrupodepesquisa(PENARIOLetal.,2022,figura1;DEOLIVEIRAetal.,2022,tabela1). Resumidamente,foramrecrutadasmulheresde 18 a 40 anos,comciclomenstrualeumenorreico,semusode medicaçãoanticoncepcionalhá trêsmesesantesdacoletae semnenhumadoençasistêmica.Paraogrupocaso,foramincluídas10mulherescomdiagnósticolaparoscópicoe histológicodeendometrioseestágioIII/IVdeacordocomoscritériosdefinidospela(ASRM,1997)ecomimagemultrassonográficasugestivade endometriomapréviaa coleta.E parao grupocontrole,foramselecionadas10pacientesférteis,submetidasalaparoscopiaparalaqueaduratubáriaatéumanoantesdacoleta,dessaformaevidenciandoausênciaclínicaecirúrgicadeendometriose. 32 Figura1:Fluxogramadecoletadasamostras. Fonte:PENARIOLetal.,2022. Tabela1:Dadosclínicosdaspacientesincluídasnoestudo. Fonte:DEOLIVEIRAetal.,2022. 33 Amostrasarmazenadasnobiorrepositório OprotocolodeisolamentodasMenSCsarmazenadasnobiorrepositóriofoiadaptadodeMENGet al.,2007conformedescritoanteriormentepornossogrupodepesquisaemZUCHERATOetal.,2021. Resumidamente,acamadadecélulasmononuclearesfoiisoladaporcentrifugaçãoemgradientededensidadea 800gpor30mina 22°CcomFicoll-Paque(#71-7167-00AG,GEHealthcareBio-Sciences,Suécia).Ascélulasforamcultivadasemmeioessencialα- mínimo(# 11900-016,Gibco,EUA)com15%desorofetalbovino(#SH30071.03,GE Healthcare- HyClone,EUA),1% de penicilina/estreptomicina(#15140-122,Gibco,EUA),HEPES10mM(#H4034,Merck,EUA)ebicarbonatodesódio20mM(#56297,Merck,EUA).Subcultivamosascélulasusandosoluçãodetripsina-EDTAa0,05%(#25300054,Gibco,EUA).As MenSCscumpremos critériosmínimosparaMSCsmultipotentes,conformedefinidopelaSociedadeInternacionaldeTerapiaCelular(DOMINICIetal.,2006), dessaforma,foramcaracterizadasimunofenotipicamentepor citometriade fluxopara 23marcadores(tabela2) (DEOLIVEIRAet al.,2022;tabela2)e foramdiferenciadasemadipócitoseosteócitos(figura2)(DEOLIVEIRAetal.,2022,FiguraS2). 34 Tabela 2: Caracterização imunofenotípica por citometria de fluxodas MenSCs. Fonte: DEOLIVEIRAetal.,2022. 35 Figura 2: Diferenciação celular das MenSCs em adipócitos e osteócitos. Fonte: DEOLIVEIRAetal.,2022. Isolamento,integridadeequantificaçãodeRNAtotal Extraçãode RNAtotal.O AllPrepDNA/RNA/miRNAUniversalKit(#80224,Qiagen,USA)foiutilizadoparaa extraçãodoRNAtotaldasMenSCs,deacordocomasinstruçõesdofabricante.EmseguidapararemoçãodeDNAcontaminante,o materialfoitratadocomAmbionDNA-freeKit(#AM1906,Invitrogen,USA).IntegridadedeRNAe quantificação.A integridadedoRNAtotalfoiavaliadanoinstrumento2100BioanalyzerInstrument(Agilent,USA)utilizandoo AgilentRNA6000NanoKit(#5067-1511,Agilent,USA).ApenasamostrasdeNúmerodeIntegridadedeRNA(RIN)igualou superiora 8 comeletroferogramascompatíveiscomRNAíntegroforam 36 incluídasnoestudo.AsconcentraçõestotaisdeRNAforamdeterminadasporfluorimetrianoFluorômetroQubit®2.0(ThermoFisher, USA)utilizandoo QubitRNABRAssayKit(#Q10210,Invitrogen,USA).. miRNoma BibliotecaparamiRNA-Seq.AsbibliotecasforamconstruídasusandooTruSeqSmallRNALibraryPrepKit(# 15004197,Illumina,EUA)de acordocomas diretrizesdofabricante.O protocoloresume-seàsetapasdeligaçãodoadaptador, transcriçãoreversa,amplificaçãoporPCRe purificaçãodabibliotecaatravésdegelagrupado.Porfim,paraavalidaçãodabiblioteca,o tamanhodosfragmentos,purezaeconcentraçãodospoolsforamavaliadosutilizandoo kit BioanalyzerHighSensitivityDNA(#G2939BA,Agilent®Technologies,EUA).Asbibliotecasforamentãonormalizadas,desnaturadasediluídasparaumaconcentraçãofinalde17pM,prontasparaosequenciamento.Clusteringe execução.AsbibliotecasgeradasforamagrupadasnaflowcellcomreagentesNexSeq1000/2000P2(100ciclos)v3usandoo equipamentoIlluminaNextSeq2000System.Foiconsideradoaceitávelaobtençãode10milhõesdeleiturasporamostra.Processamentodedadosbrutos.Osdadosbrutosdeleitura(readsFASTqfiles)foramanalisadosutilizandoo pipelinenf-core/smrnaseq(PANTANOetal.,2022;disponívelemhttps://nf-co.re/smrnaseq) e e a expressãodiferencialfoiobtidanoDESeq2(LOVEetal.,2022;LOVE;HUBER;ANDERS,2014). Emresumo,o pipelinenf-core/smrnasequsaFASTQC(ANDREWS,2010)eMULTIQC(EWELSetal.,2016)pararealizarocontroledequalidadedasleiturasdesequenciamentobrutogeradas(FASTq),TrimGalore(KRUEGERetal.,2021)eSeqCluster(PANTANO;ESTIVILL;MARTÍ,2011)paraopré-processamentodosarquivosatravésda remoçãodassequênciasadaptadorase tambéma remoçãodesequênciasmenoresdoque17pbemaioresque40pb,Bowtie1(LANGMEADetal.,2021)egenomahumano(GRCh38- (“GRCh38.p14- hg38- Genome- Assembly- NCBI”)compilamhg38paraaetapadealinhamentodemiRNAsmaduroseprecursoresdemiRNAs(hairpins)eosbancodedadosmirtop(DESVIGNESetal.,2020)emiRBase(KOZOMARA;BIRGAOANU;GRIFFITHS-JONES,2019)paraanotaçãodemiRNAseisomiRsconhecidoseinéditos.AnálisedeExpressãoDiferencial(DEmiRs).OsarquivosdecontagensdemiRNAsdopipelinenf-core/smrnaseq,queobteveumalistadosmiRNAsdescritosnomiRBasee as 37 respectivascontagensnasamostrasanalisadas,foiutilizadonopacoteDESeq2Rversão3.16(LOVEetal.,2022;LOVE;HUBER;ANDERS,2014)pararealizaraanálisedeexpressãodiferencial,baseadanocoeficientedevariaçãoentreasduascondições(endometrioseversuscontrole).Foramaplicadososfiltrosde50%dealinhamentototal,somatóriodecontagemmínimode10e expressãodomiRNAempelomenosmetadedasamostras.AsanálisesestatísticasforamrealizadascomosvaloresdecontagensbrutasusandoopacoteestatísticoDESeq2noambienteR,foiaplicadoumtesteWilcoxoneconsideramoscomoDEmiRsosmiRNAsqueapresentaramp-valormenorque0.05. FunçõesbiológicasdesempenhadaspelosDEmiRs multiMiR.ParaprediçãodainteraçãomiRNA-alvodosDEmiRs,utilizamosopacoteRmultiMiR(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/multiMiR.html, versão3.16;RUet al.,2014a,2014b), quecompiladadosdebancosexternos,comoDIANA-microT,ElMMo,MicroCosm,miRanda,miRDB,PicTar, PITA e TargetScan.O inputforamosmiRNAshsa-miR-1271-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-337-3p,hsa-miR-1304-3p,hsa-let-7c-5p,hsa-miR-337-5peselecionadososparâmetros:homosapiens, mRNAsalvopreditosesemalvosdefinidos.Cytoscape. Os dadosgeradospelomultiMiRforamanalisadosno Cytoscape(http://www.cytoscape.org, versão3.9.1)paraconstruçãodarededeinteraçãomoleculareintegraçãodosperfisdiferenciaisdeexpressãodegenese demiRNAs(SHANNONetal.,2003). WebGestalt(WEB-basedGeneSeTAnaLysisToolkit).Utilizamosa ferramentaWebGestalt(https://www.webgestalt.org/, versão2019)paraanálisede enriquecimentofuncionaldosgenesreguladospelosDEmiRs(LIAOetal.,2019). OsdadosgeradospeloCytoscapeforamfiltradosapartirdosgrausdecentralidade4a7,ouseja,4oumaismiRNAsregulandoo mesmoalvo,e foramutilizadosparaanálisedeenriquecimentofuncional.Osparâmetrosbásicosaplicadosforam:Homosapienscomoorganismode interesse,Over-RepresentationAnalysis(ORA)comométododeinteresse,pathwaysbancosdedadosfuncionalKEGGe Reactome.Paraa listadegenesselecionados,o símbolodogenefoiutilizadocomotipode ID e inserimosa listaprovenienteda análisedo MultimiR.Selecionamostambémogenomacomolistadegenesdereferência. 38 ValidaçãoquantitativadomiR-1271-5pporRT-qPCRRT-qPCR.QuantificamosaexpressãodomiR-1271-5p,umdosDEmiRsobtidopelaanálisedomiRnoma,porRT-qPCR,utilizandoo sistemaTaqManAdvancedmiRNAassay(cat.A25576,AppliedBiosystems,EUA).As reaçõesde corridaforamrealizadasemtriplicatapara10 amostrascasoe 10 controles,sobasseguintescondições:5μ L de2XTaqManFastAdvancedMasterMix(#4444557,AppliedBiosystems),0,5μ L de 20XTaqManAdvancedmiRNAassay(cat. A25576,AppliedBiosystems),2,5 μ L decDNA-pre-ampdiluído1:10e2μ Ldeágualivredenucleases,totalizando,10μ Ldevolumefinaldereação.Ascondiçõesdeciclagemaplicadasforam50°Cpor2minutos,95°Cpor20segundos,40ciclosde1 segundoa 95°Ce 20segundosa 60°CnoequipamentoViiAReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystem,EUA).ConsideramosaceitáveisasréplicastécnicascomadiferençamáximaentreosvaloresdeCq(quantificaçãodeciclos)paraaté0,3ciclos.Foiincluídoemtodasasplacasumcontrolenegativo,noqualfoiadicionadoágualivredenucleasesaoinvésdaamostra,nãohouveamplificação(Cq= indetectável).Alémdisso,avaliamosa eficiênciadeamplificação(E%)detodasassondasutilizadasatravésdeumacurva-padrãocom8 pontosemdiluiçãoseriada1:2deumpooldecDNA-pré-ampdetodasas amostras,sendoo primeiropontoda curvadiluídoa 1:16.Selecionamosaconcentração1:32paraesseestudo.OsoftwaredopróprioequipamentofoiutilizadoparaocálculodaE%,conformearecomendaçãodofabricante(THERMOFISHERSCIENTIFIC,2006), foramconsideradascomoaceitáveisE%entre90e110%.Nívelde expressãorelativa(RQ).O nívelde (RQ)parao miRNAanalisadofoicalculadoparacadaamostradeacordocomo métodode2 -ΔΔ CT (LIVAK;SCHMITTGEN,2001) utilizandoo Thermo Fisher Connect Platform®disponívelonline(http://www.thermofisher.com/br/en/home/digital-science/thermo-fisher-connect.html). UmpooldecDNAdasamostrascontrolefoiutilizadoparaocálculodenormalizaçãodosdadoscomoaamostradereferência.Sondasde hidrólise.As sondasde hidróliseTaqManGeneExpressionAssays(#4331182,ThermoFisherA)utilizadasforam:hsa-miR-1271-5p(AssayID:478674_mir),como alvo, e hsa-miR-191-5p(477952_mir),hsa-miR-24-3p(477992_mir),ehsa-miR-103a-3p(478253_mir),comogenesdereferência,escolhidoscombasenamaiorestabilidadeapresentadaemMenSCs(HACIMOTOetal.,2023).Análisesestatísticas.AsanálisesforamrealizadasusandooSASStatisticalSoftware(versão9.4;SASInstitute,Inc.Cary, NC,EUA).Inicialmente,testesdehomogeneidadede 39 variânciasedistribuiçãodefrequênciaderesíduosforamrealizadospormeiodehistogramase testesemPROCUNIVARIATE(SASInc.,Cary, NC,EUA).AtransformaçãologarítmicadosdadosRQfoidesnecessária,poisassuposiçõesdelinearidadeforamatendidas.OtestetparaamostrasindependentesfoiaplicadodeacordocomosprocedimentosdoGeneralLinearModelparacompararos valoresmédiosde RQ(2 -ΔΔ Ct ) entreos gruposcontroleeendometriose.OsvaloresmédiosdeRQforamusadosparacalcularamudançanaexpressãogênicanogrupocontroleemrelaçãoaogrupocaso.Osparâmetrosdesignificânciaforamα=0,05,poderdoteste(1-β)foidepelomenos0,8eddeCohen=0,4. 40 RESULTADOS 41 Fluxodetrabalhodoestudo Nafigura3 estárepresentadoo fluxodetrabalhodoestudo,onde10amostrasdeMenSCsporgrupo(casos:E2,E3,E4,E7,E8,E9,E11,E12,E13,E27e controles:C10,C17,C22,C29,C31,C32,C34,C35,C38,C39)foramselecionadasinicialmenteparaesseestudo.TodasasamostraspassarampelocontroledequalidadeeintegridadedeRNA,poisapresentaramRINmaiordo que8 (figura4). Noentanto,só foi possívelrealizaromiRNA-Seqde19amostras,umavezqueumadasamostrascontrole(C10)foiexcluídapornãoapresentaraconcentraçãodeRNAtotalmínimarecomendadanoprotocolodeconfecçãodasbibliotecas(200ng/mL).ApósaexecuçãodosprotocolosdeNGSeanálisedequalidadedosdadosbrutosgeradosforamincluídasnasanálisesdeexpressãodiferencial(DEmiRs)8amostrascasose7controles,assim4amostrasforamexcluídasdasanálisesestatísticasedeenriquecimentofuncionalpornãoterematingidopelomenos50%dealinhamentocomogenomabase.ParaasanálisesdeRT-qPCRforamincluídasas10amostrasporgrupo. 42 Figura3:Fluxogramadoestudo 43 Figura 4: Os eletroferogramas das amostras foram obtidos com a aplicação do Agilent 2100Bioanalyzer e RNA600 Nano kit. ONúmerode Integridade doRNA(RIN) foi realizadousandoosoftwareAgilent2100ExpertB.02.07.SI532.C:controle;E:endometriose. 44 miRNoma Processamentodedadosbrutos.UmresumodosresultadosgeradospeloMultiQCéapresentadonatabela3. Trêsamostrasdogrupocaso(E3,E7,E11)eduascontroles(C39,C35)foramexcluídasdas análisesde expressãodiferencialpor não apresentaremporcentagemdealinhamentosuficiente(<50%). Tabela3:ResultadosobtidosnoMultiQCparacadaamostrasequenciadaquantoaosmilhõesdeleiturasmapeadas,porcentagemdemapeamentoetotaldesequências Amostra LeiturasMapeadas(milhões) %Mapeada TotaldeSequênciasFastQC(milhões) C17 4.1 66,8 6.1 C22 3.8 67,0 5.6 C29 3.3 65,3 4.9 C31 5.8 71,4 8.0 C32 4.3 74,0 5.8 C34 2.6 60,5 4.2 C35 1.9 46,0 4.0 C38 3.2 57,3 5,6 C39 2.3 47,5 4.8 E11 3.6 41,4 8.7 E12 3.6 56,9 6.3 E13 4.6 65,3 6.9 E27 6.2 72,4 8.4 E2 3.6 65,6 5.4 E3 3.1 45,9 6.8 E4 2.8 69,8 3.9 E7 3.3 55,0 5.9 E8 3.7 69,3 5.3 E9 4.0 67,8 5.8 45 AnálisedeExpressãoDiferencial.ApósasanálisesdealinhamentoecontagemdosdadosbrutosobtidosnoNGS,foramencontrados1491miRNAsmaduroscomanotaçõesnobancodedadosdomiRBase,e queapósaaplicaçãodosfiltros(50%dealinhamentototal,somatóriodecontagemmínimode10readseexpressãoempelomenos50%dasamostras)restaram378miRNAsqueforamdestinadosàs análisesde expressãodiferencialpeloDESeq2no ambienteR. Consideramoscomodiferencialmenteexpressos(DEmiRs),9miRNAscomvalordep<0,05(tabela4 e figura5),sendoomiR-1271-5poúnicoDEmiRcomp-valorajustadomenorque0,05(p-ajuste0,021). Tabela4:DEmiRs miRNA log2FoldChange p-valor p-adj hsa-miR-1271-5p 1.39 5,58E+09 0.0210 hsa-miR-125b-2-3p -1.15 0.0052 0.9851 hsa-miR-181a-2-3p 0.33 0.0085 0.9851 hsa-miR-185-5p -0.69 0.0122 0.9851 hsa-miR-182-5p 0.77 0.0189 0.9851 hsa-miR-337-3p -0.89 0.0252 0.9851 hsa-miR-1304-3p -1.02 0.0308 0.9851 hsa-let-7c-5p -0.61 0.0313 0.9851 hsa-miR-337-5p -0.92 0.0375 0.9851 46 Figura5:BoxplotsrepresentativosdaexpressãodosDEmiRsemcadagrupo. 47 FunçõesbiológicasdesempenhadaspelosDEmiRs multiMiR.Os9miRNAscomsignificânciaestatísticatêmcomoalvospreditos8139mRNAs.TodasasinteraçõesmiRNA-alvopodemserobservadasnatabelasuplementar1(disponível em:https://drive.google.com/drive/folders/1wWQkRayf8zemiPf43aWyqRFB8pAQXR68?usp=sharing).Cytoscape. ArededeinteraçãomolecularmiRNA-alvogeradapeloCytoscapecomgrausdecentralidade6 e 7,ouseja6 ou7 miRNAsregulandoomesmomRNA,podeservisualizadanafigura6APode-seobservar42nós(8miRNAse34mRNAs)e208arestas(interações).Também,buscamosnaliteraturaquaisdos34genes-alvodosDEmiRshaviamsidorelacionadosà endometriose,e encontramos82%dosgenes(28)já exploradosnadoença(tabela5).Alémdisso,apresentamosnafigura6BarededeinteraçãomiRNA-alvocom7 grausde centralidade,na qual4 mRNAs(LCOR,PLS3,INO80D,TNRC6B) sãoreguladospelos miRNAs hsa-let-7c-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-1271-5p,hsa-miR-1304-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-182-5pehsa-miR-185-5p. 48 A B Figura6:RededeinteraçãomolecularmiRNA-alvogeradapeloCytoscape.A:Interaçõesparaosgrausdecentralidade6e7.OsmiRNAssãorepresentadosporlosangoslaranjaseosmRNAsporretânguloscinzaemarrom.B:Interaçõesparaograudecentralidade7.OsmiRNAssãorepresentadosretângulosazuiseosmRNAsporlosangosamarelos. 49 Tabela 5: Revisãode literatura sobre os genes regulados pelos DEmiRs(grausdecentralidade6e7)emendometriose Gene DOI LCOR https://doi.org/10.21873/invivo.12545 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2019.08.060 PLS3 https://doi.org/10.11606/D.5.2019.tde-04092019-081458 https://doi.org/10.1155%2F2010%2F369549 https://livrepository.liverpool.ac.uk/id/eprint/6273 INO80D https://doi.org/10.1093%2Fhumrep%2Fdez279 TNRC6B NA CPEB1 https://doi.org/10.1089/dna.2021.1017 PRTG https://patents.google.com/patent/US20160251718A1/en RICTOR https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijmm.2018.3967# https://doi.org/10.1016/j.lfs.2022.120805 https://www.mdpi.com/1422-0067/23/7/3416 TP53INP1 https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4660 ACTR2 https://patents.google.com/patent/US20160251718A1/en https://doi.org/10.1177%2F1933719110386241 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0015028214003124 BNC2 https://doi.org/10.1093/humrep/der169 https://doi.org/10.3389%2Ffimmu.2022.1037504 https://openarchive.ki.se/xmlui/handle/10616/40412 http://dx.doi.org/10.1016/j.ygyno.2017.02.022 MED1(MBD4) https://doi.org/10.3389/fphar.2022.932526 ONECUT2 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jcmm.16039 CBX5 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0015028213034675 50 DST https://doi.org/10.1210%2Fen.2014-1490 NAP1L1 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.12.058 CELF1 https://doi.org/10.3390%2Fbiom10091311 CPEB2 NA LEPR(OB-R) https://doi.org/10.1093/molehr/gah115 https://doi.org/10.1093/molehr/8.5.456 https://doi.org/10.1155%2F2013%2F879618 ADAMTS6 https://doi.org/10.1095/biolreprod.109.082867 FRMD5 https://doi.org/10.1186%2Fs12958-017-0319-5 LRRC7 NA PLCB4 https://doi.org/10.7717%2Fpeerj.8730 https://doi.org/10.1210/en.2006-1692 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.04.020 https://doi.org/10.1002/ijc.31768 http://dx.doi.org/10.7717/peerj.11045 https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2013.04.267 ZFHX4 https://doi.org/10.3390%2Fijms20081842 https://doi.org/10.3892%2Fetm.2019.8214 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.07.037 https://doi.org/10.1093/humrep/dez155 PCDH17 https://doi.org/10.1093/humrep/den078 https://doi.org/10.3390%2Fijms22147297 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33982-7 TCF4 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.12.058 51 https://doi.org/10.1101/2021.05.20.445037 NOVA1 NA UBE2E1 https://doi.org/10.1177/1933719116641761 ATAD2B NA TFAP2A NA SYNJ1 https://doi.org/10.4103%2F0366-6999.240808 FMNL3 https://doi.org/10.1177%2F1933719117704905 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2009.03.086 ACPP https://patents.google.com/patent/US20160251718A1/en https://doi.org/10.1210%2Fen.2014-1490 https://doi.org/10.1177%2F1933719117704905 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2009.03.086 TAOK1 https://doi.org/10.1155%2F2015%2F340218 NSD1 https://doi.org/10.3390%2Fcells10040749 WebGestalt.AanálisedeenriquecimentofuncionalmiRNA-alvoglobalfoigeradanoWebgestalt,sendoconstruídaa partirde8139genes,desses,3050estãoanotadosparaascategoriasfuncionaisselecionadasetambémnalistadereferênciaeforamutilizadosparaasanálisesde enriquecimentoe foramidentificadas136 categoriasenriquecidascomFDR<0,05,das quaisas 40 primeirasvias(top40) estãorepresentadasna figurasuplementar1, etodasasviasenriquecidaspodemserencontradasnatabelasuplementar2(disponível em:https://drive.google.com/drive/folders/1wWQkRayf8zemiPf43aWyqRFB8pAQXR68?usp=sharing). EstringindoasanálisesdeenriquecimentofuncionalmiRNA-alvoparaosgrausdecentralidade4 a 7,construímosa partirde438genes,desses,265foramutilizadosparaasanáliseseforamidentificadas10categoriasenriquecidascomFDR<0,05(figura7). 52 53 Figura7:Viasenriquecidascom265genesnoWebgestaltparaosgrausdecentralidadede4a7determinadosnoCytoscape. 54 AvaliaçãodaexpressãodomiR-1271-5pporRT-qPCRTodasas sondasutilizadasno experimentode quantificaçãoda expressãogênicaapresentameficiênciasde amplificaçãoentre90 e 110%,dentrodo recomendadopelaempresa,sendo para hsa-miR-1271-5pde 91.11%, hsa-miR-191-5pde 93.33%,hsa-miR-24-3pde 91.33%,e hsa-miR-103a-3pde 93.58%.Nãofoiobservadadiferençasignificativana expressãodo miR-1271-5palvo,nãosendopossívela validaçãodosresultadosdomiRNoma(Figura8). Figura8:BoxplotsepontosrepresentativosdosvaloresdeCtparaomiR-1271-5p.Acaixarepresentaosvaloresdequartilmínimo(Q1-25ºpercentil)emáximo(Q3-75ºpercentil).Alinhahorizontaldentrodacaixarepresentaamediana.Omínimo[Q1-(1.5*IQR)]eomáximo[Q3+(1.5*IQR)]estãorepresentadosporwhiskers.Adistribuiçãodasamostrasérepresentadaporcírculos.Opontopretorepresentaovalordamédia.IQR=intervalointerquartil(interquartilerange).Obox-plotfoicriadoutilizandooMedCalcStatisticalSoftwareversão19.5.1(MedCalcSoftwareLtd,Ostend,Belgium;https://www.medcalc.org;2020). 55 DISCUSSÃO 56 Estudosdeabordagensmulti-ômicasemMenSCsnacondiçãodeendometriosesãoescassos,sendonossogrupode pesquisao pioneiroao descrevero perfilintegradodotranscriptomae doproteomadessascélulas(PENARIOLetal.,2022). Almejandoentenderagoraos mecanismosregulatóriospós-transcricionaisnestascélulas,apresentamosaquiaprimeiraanáliseexploratóriadomiRnomadeMenSCs,e destacamosnovemiRNAscomexpressãodiferencial(hsa-miR-1271-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-337-3p,hsa-miR-1304-3p,hsa-let-7c-5p,hsa-miR-337-5p).TambémidentificamosatravésdeanálisesinsílicoviasegenesreguladosportestesDEmiRsquepossivelmenteestãorelacionadosàmecanismosmolecularesalteradosnaendometriose.OsgenesLCOR, PLS3, INO80D, TNRC6BsãoreguladosporpelomenossetedestesmiRNAs,sendotrêsgenesjáestudadosnadoençae estãoenvolvidoscomviascelularesde: silenciamentopós-transcricionalpor pequenosRNAs,RNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)reguladoresdatraduçãodoPTEN,regulaçãodatraduçãodomRNAdo PTEN,regulaçãoda expressãoe atividadeda RUNX1,senescênciainduzidaporoncogene,regulaçãoda expressãoe atividadede MECP2,regulaçãoda transcriçãoporMECP2,ativaçãodereceptoresNMDAe eventospós-sinápticos,long-termdepressionesinapseglutamatérgicaque,quandodesreguladas,podemsercruciaisparaaetiopatogeniadaendometriose. 1. Silenciamentopós-transcricionalporpequenosRNAsO envolvimentode miRNAscoma etiopatogeniadaendometrioseé amplamenteexplorado(BRAZA-BOÏLSet al., 2014;CHEGINI,2010;HAWKINSet al., 2011;KOLANSKAet al., 2021;OHLSSONTEAGUEet al., 2009;SAAREet al., 2017;SANTAMARIA;TAYLOR,2014), reforçadopelodesequilíbrionaexpressãodetranscritosesuasrespectivasproteínasemamostrasendometrióticas(FASSBENDERetal.,2010,2012;PRAŠNIKARetal.,2020;QIetal.,2020;WREN;WU;GUO,2007).A viacanônicadebiossíntesedemiRNAsenvolvea transcriçãodomiRNApelaPolimeraseII,naformadehairpin,oqualéprocessadopelomicroprocessador,compostoporDROSHAe DGCR8,o pré-miRNAé exportadoparao citoplasmaatravésdaEXP5(HA;KIM,2014).NocitoplasmaocorreaclivagemmediadaporDICER1,queresultanopequenoRNAduplafita,queapósaligaçãoaumadasargonautas(AGO1-4)formaocomplexoRISC(RNA-inducedsilencingcomplex),responsávelpeloemparelhamentodebasescomomRNA(HA;KIM,2014).CasooemparelhamentosejatotalhaveráaclivagemdomRNA,enquantoqueno casode emparelhamentoincompletohaverábloqueiodatradução,resultandoemdiminuiçãodaexpressãoeemúltimainstânciaambosalteramoperfilproteicoexpresso(HA;KIM,2014). 57 Ademais,a viadebiossíntesedemiRNAstambémpodeserreguladapormiRNAs,processoquesedáatravésdaregulaçãonegativadasproteínasatuantesnabiogênese,comoDROSHA,DICER1,AGO1-4,mecanismodeatuaçãojádescritoparaa famílialet-7(HA;KIM,2014).Dessaforma,o enriquecimentodaviadesilenciamentopós-transcricionalporpequenosRNAsdemonstraummecanismoregulatórioecompensatório,noqualosDEmiRspodematuarnasMenSCstantoanívelderegulaçãodegenesqueafetamodesenvolvimentoda endometriose,quantoemsuaviade biossíntese,sabidamentedesreguladanessetipocelular(CRESSONIetal.,2023). 2. OsRNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)reguladoresdatraduçãodoPTENeregulaçãodatraduçãodomRNAdoPTENOgenesupressortumoralPTENéassuntodeintensainvestigaçãonabiologiatumoraldevidoà perdadefunçãofrequentementeobservadaemcâncereshereditárioseesporádicos(LEE;CHEN;PANDOLFI,2018). É codificantede uma fosfataseconversoradefosfatidilinositol3,4,5-trifosfatoemfosfatidilinositol4,5-bifosfato,sendoantagonistadaviadesinalizaçãoaltamenteoncogênicadePI3K/Akt(LIetal.,1997),éresponsáveltambémporregulardiferentesprocessosbiológicos,comoa manutençãoda estabilidadegenômica,sobrevivênciacelular, migração,proliferaçãoe metabolismo(LEE;CHEN;PANDOLFI,2018). Seuequilíbrioé finamenteregulado,qualquerpequenaalteraçãoemsuaatividaderesultaemsusceptibilidadeaocâncereinduzaprogressãotumoral,mutaçõessomáticasestãoassociadasà doençaavançada,resistênciaa quimioterapiae baixasobrevida(VIDOTTOetal.,2023). Odeclíniodefunçãopodeocorrerporperdahemizigóticaqueresultanareduçãoda expressãogênicaouporperdahomozigótica,levandoà ausênciadeexpressão(LEE;CHEN;PANDOLFI,2018).AexpressãogênicadePTENtambémpodeserreguladaemnívelpós-transcricional,atravésdeRNAscodificantesenãocodificantesquepodemimpediraligaçãodemiRNAsaomRNA,denominadosRNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)(TAY et al., 2011).Transcritosdo pseudogenePTENP1e mRNAstranscritosdosgenesSERINC1, VAPA eCNOT6Lexibemessaatividade(TAY;RINN;PANDOLFI,2014).Emborahajaindíciosdequeaendometrioseapresentepotencialmaligno,atualmentea compreensãosobreosmecanismosmolecularesquelevamà transformaçãomalignadaendometrioseé limitada(MAetal.,2016). Nessecontexto,o estudodoPTENpodetrazerindíciosdecomoatransformaçãoocorre.Naendometriose,édescritaacoexistênciadeperdatotaldePTENehiperatividadedeMAPK/ERK,PI3K/AKte NF κ B no endométrioeutópicoe ectópico,sendoa perdahomozigóticaobservadaemendometriosesestágioIII e IVe a perdahemizigóticanosestágiosI, II,IIIe IV, sugerindoassociaçãoentrea diminuiçãodeexpressãodePTENeestadiodadoença(ZHANGetal.,2010). É descritoumalçadefeedbackpositivoentreo17β- estradioleNF κ B,PTENePI3K,quepodepromoveraproliferaçãodecélulasepiteliaisendometriaisectópicase contribuirparaa progressãodaslesões(ZHANGet al.,2010). 58 Processoque na endometriosepoderiaser acentuadodevidoa característicaestrogênio-dependente(KITAWAKIetal.,2002).HámaiorconsensoaosugerirqueadiminuiçãodaexpressãodePTENpareceserumeventoprecocena viade desenvolvimentodo tumora partirde lesõesendometrióticas(AKBARZADEH-JAHROMIet al., 2020), sendoevidenciadopela coexistênciadecarcinomasginecológicoseendometriose(MARTINIetal.,2002).Já osceRNAstemaplicaçãonaidentificaçãodealvospotenciaisparaestudosdemecanismosetiopatogênicosepotenciaisbiomarcadoresdeendometriose,comodescritoporXIE;YIN;LIU(2022)queestabeleceramumarededeceRNAcompostapor30miRNAsreguladoresdosgenesACLY, ADH1B, PTGFR, e MYOM1. Etambém,WANG;YU(2019)queidentificaramumarededeceRNAscompostaporDRAIC, LOC400867, hsa-miR-449c-5pehsa-miR-449a,associadosàendometrioseeenvolvidoscomviasdedecidualização,viadesinalizaçãodoVEGF, viadesinalizaçãodoTNFeesteroidogêneseovariana.ApesardeceRNAsreguladoresdoPTENaindanãoteremsidoexplorados,levandoemconsideraçãoa similaridadeentreendometrioseecâncerendometrial,comoestímulodoestrogênioe inflamaçãocrônica(YUetal.,2015), taisestruturasmostram-seinteressantesobjetosdeestudofuturoparaidentificaçãodecomoatransformaçãomalignapodeocorrereoenvolvimentodoPTENnesseprocesso. 3. RegulaçãodaexpressãoeatividadedaRUNX1RUNX1éogenecodificadordofatordetranscrição1relacionadoaoRunt(RUNX1),relacionadoàgeraçãodecélulas-troncohematopoiéticasenasuadiferenciaçãoemlinhagensmieloidese linfoides,e a perdada funçãomuitasvezesresultanodesenvolvimentodeleucemias(SOOD;KAMIKUBO;LIU,2017). Sua expressãoé controladapor doispromotores,odistalP1eoproximalP2,esuasisoformassãogeradasapartirdousodelesede splicingalternativo,asderivadasdeP2sãoexpressasemváriostecidose a isoformaderivadadeP1é restritaa célulasdalinhagemhematopoiética(MARTINEZetal.,2016).Ademais,suaexpressãotambéméautorregulada,atravésdeumalçadefeedbackpositivoemcélulashematopoiéticas,nasquaisaproteínaRUNX1érecrutadaparaseuprópriopromotor,regulandoa transcriçãodo gene RUNX1, mecanismochavepara especificaçãoediferenciaçãocelular(LIE-A-LINGetal.,2018).RUNX1pareceestarenvolvidocomo desenvolvimentodeendometrioseovariana(WANGetal.,2020), sendoaltamentereguladoporfatoresdetranscriçãojáestabelecidosnodesenvolvimentode doença,comoreceptorandrogênico,receptoresdeestrogênioα e β,FOXA2e TFAP2C(YANGet al.,2015). O quetambémjá foidemonstradoemmodeloexperimental,noqualo níveldeRUNX1mostra-se12vezesaumentado,quepoderesultaremtransduçãodesinalemcélulasimunológicase inflamatórias,induzindoa produçãodecitocinasequimiocinas(KONNOetal.,2007). Dessaforma,RUNX1podeterenvolvimentona etiopatogeniada endometrioseao contribuircom o microambienteinflamatóriocaracterístico(WU;HSIAO;TSAI,2015), alémdeseupapelintrínseconaespecificidadeediferenciaçãocelular, que podealteraro comportamentode MenSCs,favorecendooestabelecimentodelesões. 59 OutrafunçãodesempenhadapeloRUNX1eaindanãoexploradanaendometrioseéacapacidadededeterminaro fenótiposensorialnociceptivoneuronal,sendonecessárioparatransduçãodeestímulosparadortérmicae neuropática,aoregulara expressãodecanaisiônicose receptores,comoo receptoropioideMOR(CHENet al.,2006). Explorartalmecanismonaendometrioseseriainteressantedevidoa existênciadedorneuropáticaemalgumaspacientes(COXON;WIECH;VINCENT, 2021), alémdacompreensãodecomoumapossívelalteraçãodeexpressãodoreceptoropióideMORpoderiaimpactarotratamentodedor, quemuitasvezessedáatravésdeopioides(GUANetal.,2023). 4. SenescênciainduzidaporoncogeneAsenescênciainduzidaporoncogene(OIS)éummecanismoantiproliferativoativadoporsinalizaçãopró-oncogênica(CHANDECK;MOOI,2010). Inicialmente,acreditava-sequeaOISfosseumprocessodecontroledatransformaçãomaligna,noentanto,elatambémdesempenhapapelnoinícioedesenvolvimentodetumores(LIU;DING;MENG,2018). Issoocorreporqueasenescênciapersistidapodecriarummicroambienteinflamatóriopropícioàtumorigênese,principalmentedevidoaofenótipocelularsecretorassociadoà senescência(SASP)(LIU;DING;MENG,2018). Essascélulassecretamfatoresde crescimento,quimiocinas,citocinas,metaloproteinasesdematrizeproteasesqueinteragemcomascélulasvizinhasnãosenescentes,promovendoproliferação,sobrevivência,angiogêneseemetástase(LIU;DING;MENG,2018).Eventosoncogênicosvemsendoestudadosnaendometriose,eaOISnãoédiferente.Asenescênciapareceserfundamentalparaareceptividadeembrionáriaemcélulas-troncodoestromaendometrial,em pacientesnãoreceptivasas culturasprimáriasdessascélulasapresentarammaiscélulassenescentesecomSASP(TOMARIetal.,2020). Nãoéconhecidoseesseefeitoé observadoemMenSCs,deveriaserelucidadoemdetalhesnofuturoparamelhorcompreensãodeinfertilidadeassociadaàendometriose.ApresençadamutaçãooncogênicanogeneKRASemlesõesendometrióticas,mesmona ausênciade sinaisde câncer, indicaqueas célulasendometrióticaspodemsermaisresistentesà OISdo que as célulasnormais(VESTERGAARDet al., 2011). Essacaracterísticapodeajudara explicarporqueas lesõesdeendometriosetêmpotencialàcarcinogênese,eavaliarmutaçõesnoKRASemMenSCspermitiriaverificarseapotencialépré-determinadogeneticamenteoué umeventotardio,quedecorredoestabelecimentodaslesõesendometrióticas.WANG et al., 2022 ao avaliarmarcadoresde senescênciae transiçãoepitélio-mesenquimal(EMT)célulasepiteliaisdelesõesectópicasdescrevediminuiçãodeexpressãodeE-caderinae aumentodevimentina,processocaracterísticodaEMT, alémdasuperexpressãodeSIRT1, quepodesero gatilhoparaEMTe escapedaOIS.Jáosgenesβ- galactosidase, p16e MAPK, responsáveispelacomunicaçãoentreasviasdesenescênciaeEMT, têmexpressãodiminuídaemlesõesectópicasemrelaçãoaoendométrioeutópico(WANGetal.,2022). Também,édescritadiminuiçãonaexpressãodeLaminb1eaumentodep16,Ink4e IL-1 β emlesõesdeendometrioseprofundae ummeiopró-inflamatórionaslesõese no endométrioeutópico,mediadopeloSASP, sugerindoquepartedascélulas 60 endometrióticasestejamentrandoemestadodesenescência(MALVEZZIetal.,2022), oqueéestimuladopeloestresseoxidativonacavidadeperitoneal(MALVEZZIetal.,2023).Essesachadosjuntamentecomasalteraçõesdetranscritos,demiRNAsedeproteínasemMenSCs,descritasanteriormente(DEOLIVEIRAetal.,2022;PENARIOLetal.,2022),queconferemconservaçãode stemnesse ocorrênciatransiçãomesenquimal-epitelialnoendométrio,característicasquepodemindicarumperfiltransitórioentreo endométrioeutópicoe oectópico,nospermitemhipotetizarqueoprocessodesenescênciainduzidaporoncogeneparticipeda etiopatogeniada endometriose,sejapelamanutençãode célulasprogramadasgeneticamentepara a formaçãode lesõesou pela promoçãode ummicroambienteinflamatóriopropícioàtumorigênese. 5. Regulaçãodaexpressãoe atividadedeMECP2e regulaçãodetranscriçãoporMECP2O geneMECP2é codificadorda proteínaMECP2,é umimportantereguladortranscricional(CHAHROURet al.,2008). IdentificametilaçõesnoDNAatravésdeseudomíniode ligaçãometil-CpG,promovea condensaçãoda cromatinaao formarumcomplexocomas histonasdesacetilases(HDAC)ou bloqueardiretamentea ligaçãodefatoresdetranscrição(YASUIetal.,2007). SeulocusgênicoestálocalizadonocromossomoX e a perdade funçãoestárelacionadaà maioriadoscasosdesíndromedeRett,umacondiçãoneurológicaprogressivaqueafetaodesenvolvimentoeéumadasprincipaiscausasde deficiênciacognitivaem mulheres(AMIRet al.,1999). MECP2é essencialparaatividadesdecélulasnervosas,comomaturaçãodosistemanervosocentrale formaçãodesinapses,alémdemodularaplasticidadesinápticaeocomportamento(EBERTetal.,2013;LUIKENHUISetal.,2004).AexpressãodeMECP2eoutrosreguladoresepigenéticosjáfoiavaliadanacondiçãoendometriose.KAAMet al.,2011 avaliouendométriosnafaseproliferativadepacientessaudáveise comendometriose,e apóso tratamentocom17β- estradiole progesterona,osníveisde expressãode MECP2forammenoresna endometriose,poréma expressãoérestabelecidanaslesões.Tendoemvistao papelexercidopelaMECP2nocrescimentoediferenciaçãoendometrial,aexpressãovariadaaolongodociclomenstrualeaconsequentecapacidadereduzidadedecidualizaçãoe implantação(KAAMetal.,2011), questiona-seaimportânciadasMenSCsnessecontexto,quepoderiamtambémestaremalteradase dessaformapermaneceremindiferenciadas,que ao seremcarreadaspelofluxomenstrualretrógradoe sofreremmodulaçãopelofluidoperitonealpoderiamdarorigemàs lesõesectópicas.MECP2é capaztambémderegulara expressãodemiRNAs,atravésdaligaçãoaDGCR8e impedira formaçãodo complexomicroprocessador(DROSHA-DGCR8)e aconsequentesíntesedomiRNA(CHENGetal.,2014). UmdosmiRNAsafetadosporesseprocessoé o miR-199a,queregulaaexpressãodemTORemneurônioscomfenótipoRett(TSUJIMURAet al., 2015). DescrevemosanteriormentequeMenSCsendometrióticasapresentamexpressãodeDROSHAreduzida,quepodealterara expressãodemiRNAsquedependemdelaparaa biossíntese(CRESSONIet al.,2023), e tambémquea viade 61 sinalizaçãoPI3K/AKT/mTORC1estáalterada(PENARIOLet al.,2022). Tendoemvistaessesachados,permite-sequestionarseMECP2acentuariaaexpressãoalteradademiRNAseativaçãodaviaPI3K/AKT/mTORC1e poderiafavorecerprocessosdeproliferaçãocelularquelevariamaodesenvolvimentodaendometriose. 6. AtivaçãodereceptoresNMDAeeventospós-sinápticosOsreceptoresNMDA(NMDAR)sãocanaisionotrópicosdeglutamato,comaltapermeabilidadeaocálcioe sãofundamentaisparao desenvolvimentodosistemanervosocentral,processosdememória,aprendizageme neuroplasticidade,umavezqueregulamaplasticidadefuncionaleestruturaldesinapses,dendritoseneurôniosindividuais,permitindoa ativaçãode cascatasde sinalizaçãodependentesde cálcioespecíficas(BLANKE;VANDONGEN,2009). Emumasériedecondiçõespatológicase transtornosneurológicostaisreceptoresapresentamalteraçõesnosníveisdeexpressãoedefunção,aperdadefunçãolevaa defeitoscognitivose a hiperestimulaçãocausaexcitotoxicidadee subsequenteneurodegeneração(BLANKE;VANDONGEN,2009).A endometriosenãoé exceçãoa isso.É conhecidoqueessedistúrbioalteraaeletrofisiologiadosistemanervosoemcamundongos(LIetal.,2018). Estáassociadaaumamudançanaexcitabilidadedasubstânciacinzentaperiaquedutalventralemratas,estruturaassociadaà analgesia,regulaçãoautonômicae comportamentosdefensivos,atravésdealteraçõesna expressãode receptoresopióidesMORe NMDAR,quepoderesultaremhiperalgesia(TORRES-REVERÓNet al.,2016). E também,roedoresfêmeascomdorassociadaà endometrioseapresentamalteraçõesfuncionaisno córtexcinguladoanterior,hipocampoetálamo,comoahiperexpressãodeTRPV-1eNMDAR,aumentononúmerodeneurôniosapoptóticosealteraçõesnaestruturacelular, oquepoderefletirmaiorplasticidadeneuronalnessasáreasdocérebro,resultandoemamplificaçãoememóriadador(ZHENGetal.,2020).Ademais,é de conhecimentoquesobcondiçõesde dorcrônica,há ativaçãodeNMDARnamedulaespinhal,podendoresultarnoaumentopersistentedadorpormeiodaproduçãodeóxidonítricoe/ouprostaglandinas(WIERTELAKetal.,1994). Equemulherescomdorpélvicacrônicasecundáriaaendometrioseapresentammaioresníveisplasmáticosdeóxidonítrico(ROCHAetal.,2015).Sendoassim,o enriquecimentodaviadeativaçãodereceptoresNMDAe eventospós-sinápticosem MenSCsnospermitehipotetizarqueas alteraçõesneurofisiológicasobservadasempacientescomendometriosee associadasa processosnociceptivosparecemserdeterminadasmolecularmentee enriquecidaspeloóxidonítrico,contribuindoparaaorigemdaslesõesendometrióticaseaocorrênciadedorpélvicacrônica. 7. Long-termdepressionA depressãode longaduração(LTD)é ummecanismodeplasticidadesináptica,caracterizadopeladiminuiçãoduradouranaeficiênciadatransmissão,processofundamentalparacodificaçãodenovasinformações(PURVESetal.,2001). Podeserdesencadeadapela 62 ativaçãosinápticaou farmacológicade receptoresde glutamato,comoNMDARs,ereceptoresmetabotrópicosdeglutamato(mGluRs)(COLLINGRIDGEetal.,2010).A LTDespecificamente,aindanãofoiexploradana condiçãoendometriose,masdevidoàsalteraçõeseletrofisiológicasencontradasnosistemanervosoemcamundongoscomendometrioseinduzida(LIetal.,2018),mostra-seumalvointeressantedeinvestigação,umavezquepodeestarenvolvidacomanalgesia,amplificaçãoe memóriadadoratravésdoestímulodeNMDARs,e poderiapermitira identificaçãodepotenciaisalvosterapêuticosemelhoranostratamentosfarmacológicosatuais. 8. SinapseglutamatérgicaGlutamatoé o principalneurotransmissorexcitatórionosistemanervosocentral,éprecursordo neurotransmissorinibitórioácidoγ- aminobutírico(GABA),alémde seressencialparao metabolismointermediárioe sínteseproteica(BAK;SCHOUSBOE;WAAGEPETERSEN,2006). Quandoliberadona fendasinápticaatuaem receptoresionotrópicosde glutamatopós-sinápticos(iGluRs),mediandoumatransmissãosinápticaexcitatóriarápida;podeatuartambémemreceptoresmetabotrópicos(mGluRs)e exercerefeitosmodulatóriosdependentesdesegundosmensageirosconsequentedoacoplamentoàsproteínasG (FRENGUELLI,2022). Apósa açãoemseusreceptoresé removidodafendasinápticaporastrócitoscircundantes,ondeétransformadoemglutamina,liberadonoespaçoextracelulare convertidanovamenteemglutamatoporneurôniosnoterminalpré-sináptico(BAK;SCHOUSBOE;WAAGEPETERSEN,2006).Atravésda liberaçãoprolongadade sinaisde neurocinasquesensibilizamosneurôniosadjacentes,causandoumainflamaçãoneurogênica,as célulasda gliapodemcontribuirpara o desenvolvimentode dor persistente,ao contribuírempara odesenvolvimentode inflamaçãoperiférica(DODDSet al.,2016). Ademais,mediadorespró-inflamatóriosderivadosda glia,comoIL-1 β, TNF α e IFN γ aumentama sinalizaçãonociceptivanamedulaespinhal,facilitandoa neurotransmissãoglutamatérgica(DODDSetal.,2016).É descritoqueemmodelosanimaisdeendometrioseháativaçãoglialemtodoosistemanervosocentral(BASHIRet al.,2023). E quepacientescomdorpélvicacrônicaassociadaà endometrioseexibemneurotransmissãoglutamatérgicaaprimoradana ínsulaanteriore nocórtexpré-frontalmedial,principaisregiõesdeprocessamentodadorneural(AS-SANIEetal.,2016). Essesresultadospodemauxiliarnacompreensãodocomponentedesensibilizaçãocentralda dorpélvicacrônicaassociadaà endometriose.Alémdisso,oenriquecimentoda viade sinalizaçãode sinapseglutamatérgicaemMenSCspodedarindíciosqueessecomponentesejageneticamentemoduladonadoença. Pontosforteselimitaçõesdoestudo Ospontosfortesdenossoestudosãoousodecritériosdeelegibilidaderigorososparaa obtençãodeamostrasbiológicasmaishomogêneaspossíveis.Apesardisso,nesseestudo 63 piloto,nossotamanhoamostralnãopermitiua validaçãode expressãodiferencialdomiR1271-5pporRT-qPCR,sendonecessárioa validaçãodenossosachadosemcasuísticamaioresquea nossa.Outropontoa serconsideradoéaanálisedeexpressãogênicaapósocultivocelular, quepodealteraroambientecelulareatenuarasdiferençassutisencontradas,no entanto,as técnicasmaiscomumenteutilizadasparao isolamentode células-troncomesenquimaissãoa aderênciaao plástico,capacidadede diferenciaçãoemadipócitoseosteócitosecitometriadefluxopositivaparaosmarcadorescelularesCD105,CD90eCD73(DOMINICIetal.,2006), tornandoimpossívelignorarosprocessosdecultivoinvitro. Demaneirageral,asviasenriquecidaspelomiRnomapropõealteraçõesmolecularespós-transcricionaisnasMenSCs,enosfazemquestionarumapossívelfunçãodessascélulasprogenitorasnaetiopatogeniadaendometriosenosâmbitosde:sensibilizaçãocentraldadorpélvica crônica, proliferação celular acentuada ativada pelo eixoMECP2/PI3K/AKT/mTORC1,intensificaçãodomicroambienteinflamatório,diferenciaçãocelular, alémpotencializaraspectosde malignidadedaslesões.Adicionalmente,nossosresultadospodemdirecionaraidentificaçãodedesafioseoportunidadesparainvestigaçõesdemecanismosfuncionaisnasMenSCs,bemcomo,contribuiparaapromoçãodoconhecimentoacercadopapeldascélulas-troncomesenquimaisnaetiopatogeniadaendometriose. 64 CONCLUSÕES 65 1. Nesseestudopilotodo miRnomade MenSCs,relatamosnovemiRNAscomexpressãodiferencial(hsa-miR-1271-5p,hsa-miR-125b-2-3p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-337-3p,hsa-miR-1304-3p,hsa-let-7c-5p,hsa-miR-337-5p).2. OsgenesLCOR, PLS3, INO80D, TNRC6BsãoreguladosporpelomenossetedosDEmiRse são alvosparadesenhosexperimentaisfuturossobremecanismosfuncionaisnasMenSCsnaendometriose.3. Destacamosatravésdeferramentasinsilicoosprocessosbiológicos:silenciamentopós-transcricionalporpequenosRNAs,RNAsendógenosconcorrentes(ceRNAs)reguladoresda traduçãodo PTEN,regulaçãoda traduçãodo mRNAdo PTEN,regulaçãodaexpressãoe atividadedaRUNX1,senescênciainduzidaporoncogene,regulaçãodaexpressãoeatividadedeMECP2,regulaçãodatranscriçãoporMECP2,ativaçãode receptoresNMDAe eventospós-sinápticos,long-termdepressionesinapseglutamatérgica,queforamenriquecidospelasinteraçõesmiRNAs-alvosepossivelmenterelacionadoscomaetiopatogeniadaendometriose. 66 REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS AKBARZADEH-JAHROMI,M.etal.EvaluationofPTENandKi67ExpressioninTypicalandAtypicalEndometriosisandEndometriosisAssociatedOvarianCancer. 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