Avaliação da participação dos Mollicutes e outros microrganismos de interesse genital na endometriose humana.

Campos, G. B. Participation of Mollicutes and genital interest microrganisms on human endometriosis. 2016. 172 p. PhD thesis (Microbiology) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Endometriosis is a disease without defined etiopathogenesis characterized by the presence of the endometrium outside of uterus. The retrograde menstruation theory justify better nowadays the most of the diagnosed cases. Based on this theory, this study aimed to detect Mollicutes (Mycoplasma genitalium, M. hominis, U. urealyticum e U. parvum ), H uman Papillomavirus (HP V) and Neisseria gonorrhoeae. The analyzed clinical samples were; endocervical swab, peritoneal fluid and bi opsied lesions of endometriosis of women with endometriosis (case group) and healthy peritoneal tissues (control group) . We evaluate the association between the infectious agents detected, the clinical profile of endometriosis, the cytokine secretion profile and the expression of immune response related genes. In swab samples, the prevalence of M. hominis (Mh), M. genitalium (Mg), U. urealyticum (Uu) and HPV it was higher in the case group (43.7%, 14.1%, 8.5% and 5.9% respectively) than the control group (40.7%, 11.1%, 3.7%, 3.7% respectively). In the peritoneal fluid samples, the prevalence of the infectious agents detected it were higher in the case group (Mh: 27. 8%; Mg: 40.7%; Uu: 3 .7% and HPV: 9. 6%) than the control group (Mh: 16.7%; Mg: 20.8%; Uu: 0% e HPV: 0%) as well . In the biopsied tissue samples, the prevalence were higher in the case group for M. hominis (5.9%) and M. genitalium (13.2%), compared to the control group (Mh: 0% e Mg: 6.7%). U. parvum when detected in swab sampl es it was associated to the severity of the symptom dyspareunia (EAD ≥ 7) (p = 0.019). M. genitalium when detected in the peritoneal fluid was associated to the higher production of IFN -γ e IL -1β (p < 0.05). Increased IL -6 levels in peritoneal fluid occurred in the case and case + Mg groups (p < 0.05). TNF-α was more produced in the case group + Mg biopsied tissue when compared to the case group without infection (p < 0.05). In the group case, biopsied tissue genes of inflammatory response activation, macrophages activation, complement system and antigen present ation were upregulated. Comparing case and control groups without infe ction, genes associated to the inflammatory response, antigen presentation and macrophages activation factor were in downregulation in peritoneal fluid cells. Downregulation of inflammation genes was higher in presence of M. genitalium. Upregulation of the same genes occurred in the presence of M. hominis . The presence of mycoplasmas, particularly M. genitalium in intraperitoneal fluid, can play a key role to maintain an immune tolerance, mainly by the worsening of this profile. However , wider studies are ne cessary to understand better this immune tolerance to infectious agents.

Mollicutes. M. genitalium. M. hominis. Endometriosis. Sexually Transmitted Infection. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Célula de M. genitalium (G-37), não fixada e negativamente corada (x 750 000) .......33 Figura 2 – Dependente ciclo de vida do Papilomavírus humano................................................41 Figura 3 – Padrões histológicos da endometriose......................................................................46 Figura 4 – Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine - ASRM (1996) .............................................................................................................57 Figura 5 – Proporção de detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1................................................................................76 Figura 6 – Proporção de detecção de micoplasmas e outros microrganismos de interesse genital entre as mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle) em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1.........................................................................77 Figura 7 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de micoplasmas (Cópias/mL) em amostras de swab endocervical mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1.........................................................79 Figura 8 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1..............................................................................80 Figura 9 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de micoplasmas em amostras de tecido de biópsia em mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1...........................................................................................................................80 Figura 10 – Quantificação de citocinas em amostras de fluido peritoneal de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso) ..............................89 Figura 11 – Quantificação de citocinas em a mostras de tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso) ..............................91 Figura 12 – Quantificação de citocinas em amostras de tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso) ..............................92 Figura 13 – Análise de expressão gênica no tecido de biópsia de mulheres com endometriose (grupo caso) comparado com tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle).......................................................................................................................................93 Figura 14 – Análise de expressão gênica nas células do fluido peritoneal de mulheres com endometriose (grupo caso) comparado fluido peritoneal de mulheres sem endometriose (grupo controle) ......................................................................................................................................95 Figura 15 – Análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para M. genitalium comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas. ..............................97 Figura 16 – Análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para M. hominis comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas................................................................................................................................99 Figura 17 – Análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para qualquer micoplasma comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas.....................101 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Genes avaliados pelo kit Human Innate and Adaptive Immune Responses PCR Array…........................................................................................................................................66 Tabela 2 – Características demográficas da população estudada..............................................69 Tabela 3 – Características clínicas da população estudada e distribuição das pacientes de acordo com as classificações da endometriose.......................................................................................71 Tabela 4 – Hábitos de vida da população estudada.....................................................................72 Tabela 5 – Perfil de detecção de espécies de Mollicutes (M. hominis , M. genitalium , U. urealyticum e U. parvum) , HPV e N. gonorrhoeae , em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1...........................................................................................................................74 Tabela 6 – Detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP.............................................................................82 Tabela 7 – Perfil de Detecção de HPV por amostra clínica e de N. gonorrhoeae no swab endocervical, por meio da qPCR, e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose...............................................................................................................................84 Tabela 8 – Detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae em amostras de swab por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas......................................................................................................................................85 Tabela 9 – Detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas......................................................................................................................................86 Tabela 10 – Detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae em amostras de tecido por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas......................................................................................................................................87 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A – Adenina AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida APC – Célula Apresentadora de Antígeno ASRM – Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva atm – Atmosfera ATP – Adenosina tri-fosfato C – Citosina cDNA – DNA circular CDC – Centers for Disease Control and Prevention CO2 – Gás carbônico Ct – Cycle Treshold (Sinal de fluorescência que pode ser detectado) DAMPS – Padrões Moleculares Associados a Danos DIP – Doença Inflamatória Pélvica DIU – Dispositivo Intrauterino DNA – Ácido Desoxirribonucleico dNTP – Deoxinucleotídeo trifosfato EDT – Endometriose EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético g – Força G (gravitacional) G – Guanina HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana HPV – Papilomavírus humano IC – Intervalo de Confiança IFN-γ – Interferon gama Ig – Imunoglobulina IL – Interleucina IL-1α Interleucina 1 Alfa IL-1β – Interleucina 1 Beta IST – Infecção Sexualmente Transmissível kDa – Kilodaltons Kpb – Kilopares de bases LPS – Lipopolissacarídeo mg – Miligramas MgCl2 – Cloreto de Magnésio mín. – Mínima máx, - Máxima MHC – Complexo Maior de Histocompatibilidade mL – Mililitro mM – Milimolar NaCl Cloreto de sódio NK – Natural Killers ºC – Graus celsius OMS – Organização Mundial de Saúde OR – Odds Ratio PAMP – Padrão Molecular Associado a Patógenos pb – Pares de base PBS – Tampão fosfato (Phosphate Buffer Saline) PCR – Reação em Cadeia da Polimerase pH – Potencial hidrogênio iônico pmol – Picomol PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PPLO – Pleuropneumonia-like Organisms qPCR – PCR quantitativa ou PCR em tempo real r2 – R da curva RNAm – Ácido ribonucleico mensageiro rRNA – RNA ribossômico SC – Small Colony T – Timina TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Th – Células T helper TLR – Toll-like receptor TNF – Fator de Necrose Tumoral U – Unidade UNG – Uretrite não gonocócica µL – Microlitro µm – Micrômetros µM Micromolar nm – Nanômetros µm/s – Micrômetros por segundo VB – Vaginose bacteriana x – Vezes (multiplicação) α – Alfa β – Beta SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 22 2 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................. 25 2.1 Características gerais dos Mollicutes........................................... 25 2.1.1 Mycoplasma genitalium.................................................................. 32 2.1.2 Mycoplasma hominis...................................................................... 35 2.1.3 Ureaplasma spp. ........................................................................... 37 2.2 Outros microrganismos de importância ginecológica................ 39 2.2.1 Papilomavírus humano (HPV)........................................................ 39 2.2.2 Neisseria gonorrhoeae................................................................... 42 2.3 Endometriose.................................................................................. 43 2.3.1 Quadro Clínico............................................................................... 44 2.3.2 Epidemiologia da Endometriose..................................................... 45 2.3.3 Classificação da endometriose...................................................... 45 2.3.4 Teorias da Endometriose............................................................... 47 2.3.5 Sistema imune e endometriose...................................................... 48 2.3.6 Microrganismos patogênicos e endometriose................................ 49 3 OBJETIVOS......................................................................................... 53 3.1 Objetivo geral................................................................................... 53 3.2 Objetivos específicos...................................................................... 53 4 PACIENTES E MÉTODOS................................................................... 54 4.1 Pacientes.......................................................................................... 54 4.1.1 Locais do estudo e pacientes......................................................... 54 4.1.2 Critérios de inclusão....................................................................... 54 4.1.3 Quadro clínico................................................................................ 55 4.1.4 Estadiamento da Endometriose..................................................... 56 4.1.5 Locais da doença........................................................................... 58 4.2 Coleta de amostras e processamento em laboratório................. 58 4.2.1 Swab endocervical......................................................................... 58 4.2.2 Fluido Peritoneal............................................................................ 58 4.2.4 Lesão de Endometriose................................................................. 59 4.3 Padronização das cepas utilizadas............................................... 59 4.4 Extração de DNA............................................................................. 60 4.5 Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR).................................................................................................... 60 4.5.1 Reação de controle interno da qualidade do DNA......................... 60 4.5.2 qPCR para detecção de M. genitalium........................................... 61 4.5.3 qPCR para a detecção de M. hominis............................................ 61 4.5.4 qPCR para detecção de U. urealyticum......................................... 62 4.5.5 qPCR para detecção de U. parvum............................................... 62 4.5.6 qPCR para detecção de N. gonorrhoeae....................................... 62 4.5.7 Análise dos dados da PCR quantitativa......................................... 63 4.5.8 PCR para detecção de Papilomavírus humano (HPV)................... 63 4.6 Dosagem de citocinas.................................................................... 64 4.7 Análise de expressão gênica......................................................... 64 4.8 Análise estatística........................................................................... 68 5 RESULTADOS..................................................................................... 69 5.1 Características demográficas da população estudada............... 69 5.2 Características clínicas da população estudada......................... 70 5.3 Hábitos de vida da população estudada....................................... 72 5.4 Perfil de prevalência dos microrganismos na população estudada................................................................................................. 72 5.4.1 Perfil de prevalência dos Microrganismos Vs Uso de hormônios... 74 5.5 Perfil de coinfecção e proporção de microrganismos nos grupos de estudo.................................................................................. 75 5.6 Perfil de carga microbiana dos Mollicutes nas amostras .......... 78 5.7 Detecção microbiana de acordo com o perfil clínico.................. 81 5.8 Padrões de resposta imune na população estudada.................. 88 5.9 Perfil da expressão gênica na população estudada.................... 93 6 DISCUSSÃO........................................................................................ 102 7 CONCLUSOES.................................................................................... 116 REFERÊNCIAS....................................................................................... 118 APÊNDICES........................................................................................... 141 A – Tipo de cirurgia realizada por grupo de estudo................................ 141 B – Ficha de atendimento ginecológico ambulatorial.............................. 144 C – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras swab endocervical de acordo com o uso de hormônio...................................... 147 D – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras de fluido peritoneal de acordo com o uso de hormônio........................................... 148 E – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras de tecido de biópsia de acordo com o uso de hormônio............................................... 149 F – Perfil de prevalência de HPV por amostra clínica e N. gonorrhoeae nas amostras de swab de acordo com o uso de hormônio....................... 150 G – Prevalência de coinfecção de Mollicutes (M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum), HPV e N. gonorrhoeae em amostras de swab endocervical de mulheres com e sem endometriose, São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1. ............................................................................... 151 H – Prevalência de coinfecção de micoplasmas genitais (M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum ) em amostras de fluido peritoneal de mulheres com e sem endometriose, São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1....................................................................................... 152 I – Prevalência de coinfecção de micoplasmas genitais (M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum ) em amostras de tecido de biópsia de mulheres com e sem endometriose, São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1................................................................................................... 153 J – Detecção de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR e m tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1.................................................................... 154 K – Detecção de Mollicutes em amostras de tecido de biópsia por PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1................................................................................ 155 L – Detecção de HPV e N. gonorrhoeae em amostras clínicas por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1.................................................................... 156 M – Detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose............................................................................. 158 N – Detecção de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose............................................................................... 159 O – Detecção de Mollicutes em amostras de tecido de biópsia por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose............................................................................... 160 ANEXOS................................................................................................. 161 A – Parecer 1170/CEPSH....................................................................... 162 B – Parecer AVAP GBC 260................................................................... 163 C – Parecer nº 550.484........................................................................... 164 D – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.................................. 165 E – Escala Analógica de Dor (EAD) ....................................................... 167 F – Questionário de dados clínicos do Setor de Endometriose do Hospital das Clínicas............................................................................... 168 22 1 INTRODUÇÃO A endometriose é uma desordem ginecológica estrógeno-dependente caracterizada pela presença de tecido endometrial fora do útero – principalmente no peritônio pélvico (ACIEN; VELASCO, 2013; GIUDICE; KAO, 2004). O quadro clínico da endometriose é bastante variável. Algumas pacientes podem ser assintomáticas, no entanto, a maioria apresenta queixas clínicas em diferentes intensidades, como dismenorreia, dor pélvica crônica, infertilidade, dispareunia de profundidade, sintomas intesti nais e urinários cíclicos como dor ou sangramento ao evacuar/urinar durante o período menstrual e fadiga crônica (BELLELIS; PODGAEC; ABRÃO, 2011; NACUL; SPRITZER, 2010) . Dentre outros fatores, a eventual inespecificidade do quadro clínico e a falta de correlação entre sintomas e gravidade da doença podem explicar a demora no diagnóstico da endometriose (BELLELIS et al., 2011). Diferentes teorias têm sido propostas para explicar a endometriose. Dentre estas estão: (1) Teoria da metaplasia celômica (Teoria de Mayer); (2) Teoria da Implantação de Sampson (crescimento do endométrio após a menstruação retrógrada) e (3) Teoria da Indução. A teoria de Mayer propõe que a endometriose se estabeleça por meio da transformação celular hormônio - dependente das células per itoneais em células do tipo Mulleriano. De acordo com a teoria da implantação, no fenômeno da menstruação retrógrada o tecido endometrial fluiria através das tubas de falópio até alcançar a cavidade peritoneal. Ao alcançar este sítio anatômico o tecido end ometrial pode se implantar e crescer. Finalmente, a teoria da indução é uma combinação das duas primeiras teorias e propõe que fatores biomecânicos e imunológicos induzem células indiferenciadas para diferenciadas em tecido endometrial (AUGOULEA et al., 2012; MEYER, 1919; SAMPSON, 1927; VINATIER et al., 2001). A teoria da menstruação retrógrada explica a maior parte dos fenômenos associados à patogênese da doença e, portanto, é mais aceita atualmente. Contudo, se este fenômeno é comum e ocorre na maioria das mulheres, questiona-se: por que apenas 10% destas desenvolvem a doença? Duas hipóteses para a progressão da doença foram postuladas: (1) Anomalias intrínsecas do endométrio eutópico permitem a resistência à eliminação pelas células imunes peritoneais e (2) a doença é uma consequência da função 23 alterada de macrófagos e células natural killer (NK), as quais são incapazes de eliminar os implantes endometrióticos. A relação entre estas duas hipóteses não está clara; estas são provavelmente interdependentes (ACIEN; VELASCO, 2013). Para além destas hipóteses, recentemente, aumentou -se o interesse ao da relação entre a patogênese da endometriose e a possível participação microrganismos (KHAN et al., 2010; KHAN et al., 2014; KHAN et al., 2015; KHAN et al., 2016; KOBAYASHI et al., 2014). O trato genital inferior está exposto à colonização por microrganismos capazes de ascender e infectar o trato genital superior (DEB; CHATTURVEDI; JAISWAL, 2004; LARSEN; GALASK, 1980; WIRA et al., 2005) . Com base neste aspe cto, na “teoria da contaminação bacteriana ou infecciosa” propôs-se que a ativação bacteriana via LPS/TLR -4 pode provocar inflamação pélvica com aumento da endometriose (KHAN et al., 2010). Em outro estudo, Khan et al., (2014) encontraram altas concentrações de Escherichia coli , Gardnerella spp., Streptococcus (alfa-hemolíticos) e enterococos em amostras de endométrio de mulheres com endometriose, e subsequente alto nível de endotoxina. O estudo reforçou o argumento de que microrganismos presentes na cavida de uterina podem provocar uma infecção subclínica no ambiente intrauterino e nos endometriomas de ovário. Estes autores propõem como possível explicação para seus achados que a menstruação retrógrada seja o fenômeno que carreou os microrganismos até os ovários. Desta forma, apoiaram-se na teoria de Sampson para postularem suas suspeitas. Neste contexto, a presença de microrganismos no útero pode ser importante na iniciação da endometriose. A ativação da resposta imune por estímulo microbiano nos receptores de reconhecimento de patógenos (RRP) resulta na ativação de vias pró -inflamatórias e da imunidade inata. Somado à resposta a vários padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), os receptores Toll-like também reconhecem ampla variedade de padrões moleculares associados a danos (DAMPs). A expressão aumentada dos níveis de DAMPs pode estar envolvido em um subsequente processo de transcrição nuclear dependente do fator-kβ (KOBAYASHI et al., 2014). Diante do exposto, consid eramos que há pouco conhecimento da participação dos micro -organismos na evolução e desenvolvimento da 24 endometriose. Há fortes indícios de que os microrganismos são carreados para o trato reprodutivo superior por meio da menstruação retrógrada. Assim, o presente estudo se propõe a investigar a hipótese se microrganismos de importância clínico -ginecológica, podem influenciar na resposta imune local e contribuir para o desenvolvimento da endometriose. Somado a este estudo, serão observados os aspectos demográficos da população incluída com vistas a avaliar os aspectos associados ao perfil clínico. 25 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Características gerais dos Mollicutes Há mais de 100 anos, fizeram o primeiro relato de micoplasmas (Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC - agente da pleuropneumonia bovina) (NOCARD; ROUX, 1990) . Com o passar dos anos, microrganismos, ainda denominados PPLO (pleuropneumonia-like organisms), foram isolados de humanos e de animais por outros pesquisadores. Atualmente, estes recebem a denominação proposta por Edward e Freundt (1956): Micoplasmas. Esta nomenclatura é usada informalmente quando se fala de bactérias pertencentes à classe Mollicutes. Apesar de informais , termos como micoplasmas ou molicutes t êm sido utilizados indiferenciadamente pelos autores para denotar qualquer espécie dentre os Mollicutes (RAZIN; HAYFLICK, 2010). Taxonomicamente, a ausência completa da parede celular separa os micoplasmas de outras bactérias em uma classe denominada Mollicutes (mollis: mole; cutis: pele, em latim) (RAZIN, 1978). Atualmente são reconhecidas cinco ordens ( Mycoplasmatales, Entomoplasmatales, Acholeplasmatales, Anaeroplasmatales e Incertae sedis ), seis famílias ( Mycoplasmataceae, Entomoplasmataceae, Spiroplasmataceae, Acholeplasmataceae, Anaeroplasmataceae e Erysipelothrichaceae) e 14 gêneros (Mycoplasma, Eperythozoon, Haemobartonella, Ureaplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroplasma, Erysipelothrix, Bulleidia, Holdemania e Solobacterium) (BERGEY’S, 2010; RAZIN, 1997). Os Mollicutes possuem um genoma e metabolismo reduzido , e s ão considerados os menores organismos capazes de autorreplicação. A espécie Mycoplasma genitalium apresenta genoma de 580 Kpb, sendo o menor genoma dentre os proc ariotos de vida livre (BERGEY’S, 2010; BOVÉ, 1999; RAZIN, 1997; RAZIN; YOGEV; NAOT, 1998) . Filogeneticamente, com base no sequenciamento d o gene 16S rRNA, são relacionada s às bactérias gram - positivas com baixo conteúdo G+C (23 - 40%) (MANILOFF et al., 1992). Por um processo de evolução redutiva do seu genoma e provavelmente influenciado pelos nichos encontrados, estas bactérias desenvolveram características fenotípicas e metabólicas diferenciadas (PERRY; KASPER, 2000). 26 O tamanho do genoma divide estas bactérias em dois grupos : (1) composto pelos gêneros Mycoplasma e Ureaplasma, com aproximadamente 580 a 1350 Kpb e, (2) formado pelos gêneros Acholeaplasma, Spiroplasma e Anaeroplasma com genoma variando de 790 a 2200 Kpb (MILES; NICHOLAS, 1998). A ausência de parede celular propicia o pleomorfismo destas bactérias. Alguns gêneros apresentam-se helicoidais, esféricos ou periformes, com ou sem filamentos. Os filamentos ocorrem pela assincronia entre a divisão celular, mais rápida, e a replicação genômica; assemelhando-se aos dos fungos ( mykes: fungo e plasma: formação). Os micoplasmas não possuem flagelos, mas algumas espécies exibem motilidade por deslizamento em superfície de plástico ou vidro. Estas espécies normalmente apresentam uma organela ou estrutura especializada na extremidade da célula (tip organelle) a qual desempenha um papel na adesão às células hospedeiras. Pequenos e maleáveis, os micoplasmas foram também confundidos no passado com vírus por transporem usualmente os filtros retentores da maioria das bactérias (RAZIN; TULLY, 1995). No cultivo em meio sólido, as colônias possuem de 50 a 500 µm de diâmetro e têm aspecto de “ovo frito”. Incorporadas no Agar, as colônias têm uma zona central opaca, granular e refringente e outra plana e translúcida na superfície do meio. No entanto, esta morfologia depende das condições de crescimento, idade da cultura e da concentração do ágar. Poucas espécies não apresentam as colônias em forma “ovo frito” sob quaisquer condições de cultivo. Em meio líquido, o cre scimento geralmente não causa turvação, provocando a alteração de cor no caldo revelado por um indicador de alteração de pH. Neste sentido, apesar de a coloração de Gram não permitir a identificação por não apresentarem parede celular, esta técnica serve para evidenciar a contaminação por outras bactérias nos caldos de cultivo (RAZIN, 1987; RAZIN; TULLY, 1995). Na caracterizaçã o morfológica dos micoplasmas, a microscopia óptica apresenta-se como técnica utilizada na visualização de estruturas mais grosseiras. A microscopia eletrônica, por sua vez, permite a visualização detalhada da ultraestrutura destes microrganismos e desta forma, a demonstração de uma membrana em finas secções; requisito para a identificação de um novo isolado como um Mollicutes (RAZIN; HAYFLICK, 2010). Os micoplasmas são encontrados em humanos, mamíferos, aves, répteis, peixes, artrópodes e plantas. Novas espécies de hospedeiros e de Mollicutes 27 são frequentemente mencionados na literatura (HORNOK et al., 2012; LO et al., 1991; MAGGI et al., 2013; VERTERAMO et al., 2013). Micoplasmas usualmente exibem uma relação estrita e específica com o tecido do seu hospedeiro, provavelmente por conta do modo de vida parasitário e por serem nutricionalmente exigentes (RAZIN et al., 1998; ROTT EM; NAOT, 1998) . Entretanto, Goulet et al., (1995) mencionam existem variações nesta relação e, eventualmente, é possível isolar espécies de sítios de hospedeiros não-usuais. M. pneumoniae pode encontrado preferencialmente no trato respiratório, e M. genitalium tem sido isolado do trato urogenital, mas o contrário também pode ocorrer. M. salivarum foi isolado da secreção nasal e orofaríngea de suínos, mesmo este sendo comumente encontrado na cavidade bucal humana. Acholeplasma oculi , um micoplasma que foi detectado em vários animais, foi isolado de líquido amniótico de uma mulher. Apesar dos relatos, o mecanismo de indução da susceptibilidade do hospedeiro a micoplasmas incomuns ainda é incerto (BOVÉ, 1999; ERICKSON; ROSS; BOVE, 1988; RAZIN et al., 19 98; WAITES; CROUSE; CASSELL, 1993). O isolamento de Mollicutes de amostras clínicas depende de várias condições inerentes aos hospedeiros ao material colhido; além do tempo decorrido até o início da cultura. Inclui-se a presença de anticorpos, antibióticos, componentes tóxicos ou inibidores, qualidade dos meios de cultura e condições de incubação. Adicionalmente, vale considerar que algumas espécies são muito fastidiosas. Desta maneira, as técnicas de diagnostico molecular são cada vez mais aplicadas (AMIRMOZAFARI et al., 2009; BALABANOV et al., 2006; TULLY, J. G., 1993). As principais espécies que parasitam humanos encontram -se nos gêneros Mycoplasma e Ureaplasma, os quais possuem metabolismos distintos. Pela forma de obtenção de ATP, os molicutes em geral, são divididos em fermentadores da glicose, acidificando o caldo de cultura ou aqueles que alcalinizam pela hidrólise da arginina. No entanto poucas espécies possuem as duas vias ou algumas obtém energia por outras vias (BROWN; WHITCOMB; BRADBURY, 2007; OLSON et al., 1993) . As espécies do gênero Ureaplasma requerem ureia para produzir ATP, hidrolisando est e composto e produzindo amônia (BROWN et al., 2007; POLLACK; JONES; WILLIAMS, 1993) . Quando são isolados de matérias clínicos contaminados, adicionam-se impedientes aos 28 meios de cultura como penicilina, acetato de tálio e antifúngicos. Algumas espécies requerem cofatores complexos pelas limitações metabólicas e/ou nutricionais. Também deve -se considerar a produção de compostos do metabolismo primári o e o esgotamento de nutrientes essências como fatores estressantes que prejudicam os subcultivos ou mesmo inviabilizando a multiplicação (MILES, 1992; ROSENGARTEN et al., 2000; TULLY, 1993). A maioria dos Mollicutes são facultativos, e geralmente prefer em atmosfera com pouco oxigênio, principalmente no primocultivo. O gênero Anaeroplasma e Asteroleplasma abarcam poucas das espécies que são pouco estudados e são anaeróbios estritos. Somente poucas espécies , como M. hyorhinis de suínos, requerem atmosfera anaeróbica, sendo que a aeração pode contribuir para o crescimento de algumas espécies, presumivelmente, por contribuir na produção de ATP gerado durante o metabolismo da glicose e outros carboidratos (KOTANI et al., 1990; MILES, 1992). A maioria dos Mollicutes isolados do homem e de animais exibem temperatura ótima de crescimento de 36 ⁰C a 38 ⁰C, enquanto que Acholeplasma spp. podem se multiplicar em temperatura ideal igual ou abaixo de 22 ⁰C (TULLY, 1983). Os molicutes geralmente sobrevivem em uma f aixa estreita de intervalo de pH. Para espécies encontradas em plantas e vertebrados, o pH ótimo é de 7,4 e o crescimento ocorre entre pH 6,5 a 8,0. Os ure aplasmas são exceções, sendo o pH ótimo de 6,0 a 6,5, sendo seu crescimento inibido em pH acima de 7,5 (RAZIN, 1978). A pressão osmótica ideal durante o crescimento de algumas espécies de Mycoplasma e para Acholeplasma laidlawii , em meio líquido ou sólido, foi próximo a 10 atm (LEACH, 1962) . Contudo, variações entre os diferentes gêneros e espécies, podem atingir valores de 6,5 a 32 atm, como no caso dos Spiroplasmas. Desta forma, o estabelecimento da osmolaridade constitui outro aspecto importante no desenvolvimento dos molicutes (MILES; NICHOLAS, 1998). A maioria dos Mollicutes vivem como comensais e, em muitos artrópodes, podem mesmo ser considerados simbiontes. Infecções com micoplasmas patogênicos são raramente agudas e usualmente seguem um curso crônico (RAZIN, 1997) . Os Mollicutes, principalmente as espécies encontradas em mamíferos, apesentam -se co mo "parasitas ideais", e vivem, geralmente, em homeostase com o hospedeiro, mas, por outro lado, são também considerados 29 como “oportunistas ideais”. Diversas doenças nos seus respectivos hospedeiros são causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN; HAYFLICK, 2010). Estas bactérias parecem preferir nichos com células em constante renovação, como mucosas, favorecendo a sua adesão. Algumas apresentam a capacidade de aderir e/ou invadir células fagocíticas e não -fagocíticas, tais como células epiteliais dos tra tos respiratório, urogenital, gastrointestinal, das glândulas mamárias e até mesmo de olhos e articulações (BIERNAT-SUDOLSKA et al., 2011). A propriedade de invasão em células humanas foi descrita inicialmente para M. penetrans , mas espécies de diferentes gêneros também têm sido descritas (BUIM et al., 2011; MARQUES et al., 2010; UENO et al., 2008). A capacidade de adesão e/ou invasão é facilitada primeiramente pelo o alto teor de colesterol na membrana de micoplasmas, contribuindo para que ocorra fusão com as células do hospedeiro. Além disso, alguns microrganismos apresentam uma ext ensão celular polar, afunilada em um dos pólos, contendo um núcleo eletrodenso no citoplasma. Esta estrutura, denominada tip organelle, funciona como uma organela de adesão e/ ou de invasão, devido às adesinas presentes (BASEMAN et al., 1995; JENSEN; BLOM; LIND, 1994; KRAUSE; CHEN, 1988; ROTTEM, 2003) . Outros micoplasmas apresentam bolsas na membrana que se assemelham a poços revestidos , onde a adesão e invasão nas células ocorre por um evento mediado p or receptores que se assemelham ao mecanismo de invasão de Chlamydia (MERNAUGH et al., 1993) . Após a invasão, alguns permanecem viáveis em vacúolos (JENSEN et al., 1994) , e outros localizam-se, principalmente, na região perinuclear (BASEMAN; TULLY, 1997). Propriedades biológicas dos micoplasmas têm sido descritas como determinantes de virulência. Estas incluem: 1) a geração de peróxido de hidrogênio e os radicais superóxido por micoplasmas aderentes, os quais induzem o estresse oxidativo, incluindo dano à membrana da célula hospedeira; 2) competição por nutrientes ou precursores biossintéticos, interferindo no metabolismo da célula hospedeira e sua função; 3) existência de glicocálix ou estruturas eletrodensas na superfície da ba ctéria com propriedades imunomoduladoras 4) alta frequência de variação de fase que resulta na diversidade antigênica na superfície bacteriana possibilitando a modificação da resposta imune do hospedeiro; 5) secreção ou introdução de enzimas 30 bacterianas como: fosfolipases, ATPases, hemolisinas, proteases e nucleases para o interior da célula hospedeira, causando aberrações cromossômicas e desorganização da função tissular e 6) permanência intracelular dificultando a ação de antibióticos e dos mecanismos de resposta imune contribuindo na cronicidade das doenças (CHANG et al., 2011). O quadro clínico das infecções por micoplasma em humanos e animais é mais sugestiva do efeito da modulação da resposta imunológica e inflamatória do hospedeiro do que pelos efeit os tóxicos de componentes gerados pelos microrganismos (RAZIN; HAYFLICK, 2010) . Assim, a adesão pode ser considerada o maior fator de virulência, pois pode interferir tanto com receptores quanto com os mecanismos de transporte da célula hospedeira. Esses eventos podem levar à ativação de cascatas e vias de sinalização nestas células (HOPFE et al., 2013; SIQUEIRA et al., 2013). Os Mollicutes apresentam afinidade pela membrana plasmática das células epiteliais , não fibroblásticas e de linfócitos (ZUO; WU; YOU, 2009) . Tornou-se evidente o estímulo do sistema imune hospedeiro pelos micoplasmas, refletida por um aumento da expressão de moléculas de superfície, da proliferação e a diferenciação das células do sistema imune. Ocorre ainda aumento das funções efet oras manifestadas pela libertação de diversos mediadores solúveis, que interferem na relação dos molicutes e as células imunológicas do hospedeiro (RAZIN et al., 1998). A maioria dos molicutes estudados estimulam macrófagos e monócitos na secreção de citoc inas pró -inflamatórias com atividade local e sistêmica nos hospedeiros. Foram associados aos efeitos inibitórios e/ou mitogênicos sobre linfócitos B e T, estímulo de células Natural Killers (NK) e aumento na produção das citocinas IL -6, IL-1α e IL -1β e IL -2 (LARSEN; HWANG, 2010; SUN et al., 2013; XU et al., 2013). O TNF-α é um mediador princi pal da inflamação, febre, liber ação de proteínas de fase aguda, choque séptico, e necrose hemorrágica das células tumorais. Esta citocina é produzida principalmente por fagócitos mononucleares, mas também por células T helper (Th), natural killers (NK) e outras células não relacionadas diretamente ao sistema imune. Uma vez que a maior parte das atividades de TNF-α se sobrepõem com IL-1 (um dos mediadores da inflamação produzido por fagócitos mononucleares e outras células), estas duas citocinas 31 são discutidas em conjunto. O TNF -α e IL -1 são cofatores importantes na ativação de linfócitos T e B, e promovem a proliferação e diferenciação de linfócitos em células efetoras . Ambas as citocinas regulam positivamente a atividade citocida de macrófagos e células NK e aumentam a atividade metabólica de polimorfonucleares. Ao induzir o aumento da expressão de antígenos do complexo maior de histocompatibilidade (MHC), potencializa m a apresentação do antígeno pelas células apresentadoras de antígeno (APCs). As células do sistema imune que são estimuladas por TNF -α e IL -1 expressam maiores níveis de receptores de citocinas, α- e β-quimiocinas e prostaglandinas. A capacidade do TNF-α e IL-1 em causar aumento da expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais, em conjunto com outros fatores, provoca o aumento do recrutamento de leucócitos a locais de inflamação. Além disso, favorecem a necrose local e a destruição do tecido. Ap esar de doses elevadas de TNF-α levar à inibição, “in vitro”, da replicação de células progenitoras d a medula óssea, tanto o TNF -α e IL-1 estimulam a produção do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM -CSF). Isso estimula a hematopoese “in vivo”, aumentando o conjunto de células a serem estimuladas e a quimiotaxia ao sítio da inflamação. Tais efeitos induzidos por ambas citocinas, em resposta às interações com micoplasmas, podem justificar boa parte das manifestações inflamatórias e patológicas nas infecções por molicutes (MCGOWIN; et al., 2009; MCGOWIN; POPOV; PYLES, 2009; PELTIER et al., 2007; WOOLARD et al., 2005; WU et al., 2008; YOU et al., 2008). IL-6 é outra citocina pleiotrópica e pró -inflamatória induzida por muitos molicutes. Esta citocina é produzida por monócitos e macrófagos, bem como por Th e linfócitos B e outras células não relacionadas diretamente ao sistema imune. IL-6 exi be algumas a tividades que se sobrepõem aos do TNF -α e IL -1. N o entanto, a sua principal a tividade é mediada pela capacidade de agir como cofator na diferenciação de células B e maturação em células secretoras de imunoglobulinas (Ig). A IL-6 também aumenta a expressão de rec eptor IL-2 (IL- 2R) em células a tivadas e in duz a produção de IL -2 por Th. Isso promove a proliferação de linfócitos T e amplifica a hematopoese. IL-6, assim como TNF-α e IL-1, também desencadeia a produção de proteínas de fase aguda no fígado. Vale salientar que , exceto por M. hyopneumoniae , M. mycoides subsp. mycoides, e M. salivarium, todos os micoplasmas que induzem a produção e 32 liberação de IL-6 foram identificados como mitógeno para linfócitos B de ratos (DOH et al., 2004; MCGOWIN et al., 2012; THANAWONGNUWECH et al., 2001). Há mais de 50 anos a ssociou-se à etiologia de M. pneumoniae com a pneumonia atípica humana e U. urealyticum com a uretrite não gonocócica (UNG). No entanto, outras espécies de micoplasmas foram identificadas como parte da microbiota humana. Apesar da ocorrência de diversos esclarecimentos na biologia destas bactérias em humanos, existe pouco conhecimento do papel destas bactérias quando são comensais ou quando causam doenças (KRAUSE et al., 1982) . Este aspecto continua indefinido em algumas doenças humanas envolvendo M. hominis, M. genitalium e U. urealyticum nos abortos espontâneos e neonatos de baixo peso ao nascer. M. penetrans, por sua vez, foi considerado possível cofator da AIDS. Clamídias e micoplasmas são os principais agentes das UNG e são encontrados com freq uência no trato urogenital de indivíduos aparentemente saudáveis. O efeito de um agente sobre o outro é também desafiador ao conhecimento da biologia destas bactérias. As inter-relações entre as espécies podem ocorrer nos diferentes contextos, como nas culturas celulares, em estudos com modelos animais e na situação clínica (TAYLOR- ROBINSON; JENSEN, 2011). Apesar das dificuldades de se correlacionar o resultado do isolamento de micoplasmas em amostras genitais e a etiologia de infecções no sítio anatômico, a detecção destes microrganismos é de extrema importância. Esta relevância ocorre por estes agentes estarem envolvido s em doenças como as vaginoses, uretrites e doença inflamatória pélvica considerndo-se os desconfortos gerados, as possíveis complicações consequentes destes distúrbios e a possibilidade de transmissão sexual. Desta forma, assumem papel importante ao constituir um problema de saúde pública, que necessita assistência médica adequada, sobretudo no tratamento, mesmo quando envolvidos em doenças consideradas de menor gravidade (AVELAR et al., 2007). 2.1.1 Mycoplasma genitalium Tully (1993) isolou pela primeira vez M. genitalium a partir de duas amostras de swab uretral de homens com U retrite Não Gonocócica (U NG). Na 33 ocasião, foi encontrado, nos esfregaços de amostra uretral, a presença de clamídia, Ureaplasma spp., M. hominis, e outro microrganismo que por vezes revelava motilidade em forma espiral. Após inocularem as amostras em meio SP4, recuperaram em cultura este último microrganismo. Quanto à forma e estrutura celular, M. genitalium predominantemente apresenta-se em forma de “garrafa” sendo a estrutura terminal envolvida na adesão às superfícies celulares (Figura 01). Possui entre 0,6 e 0,7 µm no comprimento, de 0 ,3 a 0,4 µm na largura da base e de 0,06 a 0,08 µm na extremidade. Ao microscópio eletrônico de transmissão, evidenciou-se também a tripla camada na membrana com 7,5 a 10 nm de largura sendo a camada intermediária mas eletrodensa em relação às demais. A estrutura terminal promove a motilidade por deslizamento e muitas cepas se movem por meio de movimentos rotatórios em sentido horário. A velocidade de locomoção pode chegar a 0,1 µm/s (HAGGERTY; TAYLOR, 2011). Figura 1 – Célula de M. genitalium (G-37), não fixada e negativamente corada (x 750 000). Legenda: A seta indica a porção terminal com a qual a célula adere às células hospedeiras. Fonte: Tully e Taylor-Robinson, 1981. M. genitalium é capaz de metabolizar glicose, c ontudo, não metaboliza arginina ou ureia. Esta característica é utilizada na detecção em meio de cultura uma vez que a diminuição do pH contribui na identificação. A temperatura ótima de crescimento é de 3 7 ºC, e as colônias se desenvolvem em atmosfera de nitrogênio com 5% de CO 2. Seu crescimento é inibido com a concentração de 0,05% de acetato de tálio. Além disso, não produz fosfatase ou filme e manchas 34 no ágar, no entan to, reduz tetrazólio anaerobica mente e sua colônia exibe hemadsorção com eritrócitos de carneiro “in vitro”. O conteúdo de G + C do DNA é de 32,4 ± 1,0 %/mol. O genoma foi totalmente sequenciado por Fraser et al., (1995), e com aproximadamente 600 Kb esta espécie possui o menor genoma relatado de um organismo capaz de autorreplicação. M. ge nitalium possui semelhança genética de 98% com M. pneumoniae. A proteína de adesão MgPa, é reconhecida por desempenhar papel fundament al na adsorção a eritrócitos, células VERO e células epiteliais das trompas de falópio (JENSEN, 2004; JENSEN et al., 1991; MOBLEY et al., 2012; MOI; REINTON; MOGHADDAM, 2009). Nos últimos anos tem aumentado o interesse em se entender melhor M. genitalium. O documento mais recente do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) sobre tratamento das ISTs, publicado em 2015, discute M. genitalium sob a ótica de um problema emergente (WORKOWSKI et al., 2015). Nos últimos anos, diferentes pesquisadores iniciaram-se estudos para comprovar que M. genitalium é de fato uma nova IST (MUNOZ; GOJE, 2016; SONNENBERG et al., 2015). Embora algumas das características clínicas e a cronologia da infecção ainda não estejam esclarecidas, os homens mais infectados apresentam uretrite, muitos com corrimento, enquanto as mulheres podem apresentar aumento de sintomas geniturinários co mo corrimento, uretrite e cervicite, ou podendo ser ainda assintomática. Os dados sugerem que este organismo contribui para alguns casos DIP, infertilidade e complicações na gravidez, podendo ser clinicamente não reconhecido devido aos sinais e sintomas br andos (HAGGERTY; TAYLOR, 2011; JENSEN, 2004; WEINSTEIN; STILES, 2011) . Em mulheres, M. genitalium já foi detectado no endométrio de mulheres com DIP, nas tubas uterinas (ASHSHI et al., 2015; ROSS; JENSEN, 2006) e na cavidade abdominal (GRZESKO et al., 2 009). Além disso, estudos sorológicos sugerem forte associação entre uma infecção passada por M. genitalium e infertilidade com fator tubário (ROSS; JENSEN, 2006). 35 2.1.2 Mycoplasma hominis O primeiro relato do isolamento de micoplasma em humano foi em 1937. O microrganismo foi coletado em cultura pura, de um abscesso do duto das glândulas de Bartholin. Na época, não havia sistema de identificação fenotípica das espécies de Mycoplasma. Contudo, acredita-se que tenha sido M. hominis pelo fato de os isola dos descritos formarem colônias grandes e serem mais comumente encontradas no trato genital. As colônias de M. hominis em ágar apresentam a característica aparência de “ovo frito” com diâmetros de 0,2 a 0,3 µm (DIENES, 1939; DIENES; EDSALL, 1937). M. hominis foi a denominação proposta para cepas que cresceram em meio semi -sólido, usualmente produzindo colônias granulares, com fraca e variável redução de azul de metileno e alcalinização do meio caldo . A ultraestrutura deste micoplasma apresentou membrana c elular trilaminar, ribossomos, material nuclear, formação de filamentos curtos, ramificados, e espaçados indicando que sua reprodução ocorre por divisão binária. Contudo, embora seja comum as formas em divisão terem tamanhos iguais, as células filamentosas ocasionalmente atingem um comprimento até 30 µm, t alvez em resposta às condições de crescimento abaixo do ideal (KRAUSE et al., 1982). A falta de enzimas para a glicólise neste micoplasma indica baixa eficácia na obtenção de energia. Considera-se que M. hominis obtém ATP suficiente da hidrólise da arginina e não da uréia pela via dihidrolase envolvendo as enzimas arginina diaminase, ornitina carbamoiltransferase e carbamate kinase. Uma segunda via que envolve a geração de ATP a partir de ADP por meio de d uas enzimas, fosfato acetiltransferase e acetato kinase, também foi proposta. Contudo, estudos mais recentes mostraram que a via não gerava como produto final AcetilCoA. De qualquer forma, a presença do gene que codifica a acetato kinase desempenha papel i mportante na produção de ATP em M. hominis. O microrganismo não produz fosfatase ou “filmes e man chas” no ágar, reduz o tetrazólio ou digere gelatina e caseína. A produção de peróxido por M. hominis é pequena, gerando apenas lise parcial de hemácias (alfa hemólise). Contudo, a produção de amônia faz elevar o pH do meio produzindo mudança da cor de amarelo para rosa. Além disso, colônias de M. hominis não são capazes de 36 realizar hemoadsorção (PEREYRE et al., 2009; TAYLOR -ROBINSON et al., 1981). O genoma da cepa PG21 de M. hominis possui um único cromossomo circular com 665.445 bp com uma proporção de G + C de 27,1 %/mol. Contém 537 possíveis sequências de DNA codificante e 14 pseudogenes. Um pequeno, mas completo, conjunto de 33 genes de tRNA foi identificado. Não foram encontradas sequências de inserção, transposons ou plasmídios endógenos no genoma. Todavia, como o relato se baseou em uma cepa padrão, é válido registrar uma variação na proporção de G + C (27,3 a 33,7 %) e no tamanho do genoma (630 a 750 pb). Por este motivo, as cepas de M. hominis apresentam considerável polimorfismo demonstrando heterogeneidade (PEREYRE et al., 2009). A patogênese de M. hominis envolve a adesão às células do hospedeiro com evidências de que proteínas de membran a são as responsáveis por ist a função. Os danos provocados por enzimas de membrana como fosfolipase e aminopeptidase ou pela produção de amônia também são fatores que contribuem na patogênese. A colonização experimental do trato genital de camundongos por M. hominis foi dependente do tratamento hormonal, sendo recuperados os microrganismos da maioria dos animais tratados com estradiol quando comparado com o grupo não tratado. O tratamento com progesterona evidenciou proteção não sendo observada a colonizaçã o em animais tratados (TAYLOR-ROBINSON et al., 1981). O fato de M. hominis ser considerado parte da microbiota do trato urogenital dificulta a compreensão do seu papel nas doenças. Por exemplo, não foi diretamente relacionado com eventos de aborto espontâ neo (FARHADIFAR et al., 2016). Todavia, evidências indiretas refletem o seu potencial patogênico, como apresentado em diversos estudos. Embora M. hominis ocorra com frequência no trato geniturinário inferior, tem sido isolado do trato urogenital superior em pacientes com sintomas de infecção aguda e pielonefrite em humanos. Quando se verificou que Gardnerella vaginalis não era o único agente responsável pela vaginose bacteriana (VB), diversos pesquisadores começaram a investigar o possível papel de M. hominis (BACZYNSKA et al., 2007; GUPTA et al., 2009; GUVEN et al., 2007). 37 Atualmente, é aceita a participação de M. hominis na VB, mas o seu papel na doença ainda é desconhecido (COX et al., 2016) . De maneira semelhante, também há dúvidas sobre sua associação com casos de doença inflamatória pélvica (DIP). Como existem indicações de que este tenha um papel patogênico primário em alguns casos de DIP aguda, pa rece razoável aceitar que atue de forma importante em casos de infertilidade relacionados à doença tubária. Contudo, esta participação ainda está pouco explicada. M. hominis também tem sido isolado do líquido amniótico de mulheres que apresentavam corioamnionite e subsequentemente abortaram, possibilitando, desta maneira, a associação deste micoplasma com estes eventos. (BACZYNSKA et al., 2007; GUPTA et al., 2009; GUVEN et al., 2007) . Além destes, relato recente de detecção em amostras de tecido menstrual em mulheres gregas demonstra que a participação destes em ca sos de infertilidade merecem ser investigada (MICHOU et al., 2014). 2.1.3 Ureaplasma spp. Os ureaplasmas são microrganismos pleomórficos, com morfologia que varia de acordo com a cepa, tempo de cultivo e método de observação. Desprovidos de sistema de motilidade, são bactérias microaerófilas com temperatura ótima de crescimento de 37 ºC, mas podem crescer entre 22 ºC e 42 ºC. Em meio sólido, produzem colônias de 15 a 60 μm, em pH ideal de 6,0. Os ureaplasmas obtém energia pela hidrolise da uréia . São encontrados com frequência no trato urogenital e respiratório de humanos e animais (BERGEY’S, 2010). Ureaplasma urealyticum foi inicialmente dividido em dois biova res, com 14 sorovares. Em seguida, foi reclassificado como duas espécies distintas, U. parvum (biovar 1) e U. urealyticum (biovar 2). A proposta baseou-se no tamanho do genoma, nas sequências dos genes 16S rRNA, da região intergênica do 16S- 23S rRNA, polimorfismos enzimáticos, hibridação DNA -DNA, crescimento diferencial em resposta ao manganês, subunidades do gene urease e região terminal 5’ do antígeno múltiplas-bandas (MBA) (BLANCHARD, 1990; KONG et al., 2000; TENG et al., 1994). Assim, os sorovares foram divididos de modo que os tipos 1, 3, 6 e 14 foram relacionados à U. parvum e os sorovares, 2, 4, 5, 7, 38 8, 9, 10, 11, 12 e 13 à U. urealyticum (ABELE-HORN et al., 1996; ROBERTSON et al., 2002; XIAO et al., 2010). Capazes de colonizar o trato urogenital de pessoas saudáveis, foram incluídos, anda assim, dentre os agentes infecciosos causadores de doenças urogenitais em humanos. Mesmo assim, a infecção e a distribuição destes microrganismos nos diferentes grupos populacionais podem variar em relação com vários fatores como idade, raça/cor, estado hormonal, bem como o número de parceiros sexuais da vida (ABELE-HORN et al., 1996; CORDOVA; CUNHA, 2002; POVLSEN; THORSEN; LIND, 2001; VERTERAMO et al., 2013). O U. parvum é a espécie mais comumente isolada de amostras clínicas, especialmente em mulheres grávidas. U. urealyticum foi isolado com maior frequência em mulheres que tiveram parto prematuro com o diagnóstico clínico de VB, mulheres com aborto espontâneo e mulheres com DIP. Algumas amostras genitais podem conter cepas pertencentes a ambos os biovares (XIAO et al., 2011) . O diagnóstico clínico da infecção g enital por ureaplasma é complicado de ser estabelecido, uma vez que não existe m sintomas característicos da infecção e por esses microrganismos geralmente não estarem envolvidos com patologias multicausais (WAITES et al., 2009). As duas espécies de ureaplasma estão associadas a quadros de uretrite não-gonocócica e não -clamidial (BAKA et al., 2009) , DIP , endometrite, infertilidade e às condições que podem afetar a gestação, o desenvolvimento do feto e do recém -nascido. Contribuem para o trabalho de parto pr ematuro, a corioamnionite espontânea, aborto espontâneo, prematuridade e baixo peso ao nascer. O recém -nascido exposto aos ureaplasmas pode desenvolver pneumonia, meningite, bacteremia, abscessos e displasia broncopulmonar (SUNG, 2010; XIAO et al., 2010). Ureaplasmas podem ser isolados da superfície mucosa vaginal ou cérvice de 40 a 80% de mulheres saudáveis sexualmente ativas. A infecção é transmitida por contato sexual, ou pode ocorrer de forma vertical por passagem transplacentária, e no momento do parto (WAITES et al., 2009). Ureaplasma spp. já foram isolados de recém -nascidos de mães com membranas amnióticas íntegras e parto cesáreo, indicando transmissão transplacen tária (WAITES; KATZ; SCHELONKA, 2005) . A ocorrência no trato urogenital de homens saudáveis é de cerca de 20 a 29% (KONG et al., 2000; XIAO et al., 2010). 39 A amônia, liberada pela hidrólise da uréia, pela urease dos ureaplasmas, pode ser considerada um fator de virulência, que provavelmente interfere nos tecidos adjacentes aos ureaplasm as. Outro fator de virulência é a atividade de fosfolipase A1, A2 e C. Quando a infecção atinge a placenta, as fosfolipases disparam a produção de ácido araquidônico livre. Isto pode ativar a síntese de prostaglandinas e, possivelmente, induzir o parto prematuro (DE SILVA; QUINN, 1999). O possível papel dos ureaplasmas nas doenças genitais em doenças do trato reprodutivo feminino, na gravidez ou causando infertilidade tem sido dicutido desde 1970 e ainda não há justificativas claras para muitas perguntas. A associação inicial com a infertilidade ocorreu após o cultivo destas bactérias do trato genital inferior, mais comumente em casais inférteis. Estes achados não foram encontrados de forma consistente em investigações subsequentes. Culturas de tecido endom etrial obtidos por laparoscopia também têm demonstrado que os ureaplasmas podem ser isolados, com maior frequência, de mulheres inférteis (WAITES et al., 2005). 2.2 Outros microrganismos de importância ginecológica 2.2.1 Papilomavírus humano (HPV) O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus de DNA circular de duplo filamento e diâmetro variando de 52 - 55 nm. Com genoma é envolvido pelas histonas H2a, H2b, H3 e H4, forma complexo contido no capsídeo , o qual apresenta simetria icosaédrica composto por 72 c apsômeros pentaméricos (BAKER et al., 1991; CHEN et al., 2000). O genoma possui oito fases abertas de leitura (Open Reading Frames – ORFs), divididas em precoces (E-early) e tardias (L-late), e uma região não codificadora LCR ( Long Control Region), com elementos regulatórios e sítios de ligações para fatores de transcrição viral. As ORFs precoces (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) codificam proteínas não estruturais, e as tardias (L1 e L2) codificam as proteínas do capsídeo (FEHRMANN; LAIMINS, 2003). Os HPVs podem ser classificados de acordo com sua capacidade de gerar neoplasias, enquadrando-se em HPV de baixo e alto risco oncogênico. Os de 40 baixo risco (HPV-6, 11, 40, 42, 43, 44, 55 ) estão relacionados com o desenvolvimento de verrugas e lesões de baixo grau. Os de alto risco (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59) são associados com o câncer cervical (IARC, 2012). O Dr. George Papanicolaou fez um dos primeiros relatos de lesões no colo do útero (THOMS, 1943). Ao longo dos anos, pesquisadores correlacionaram o aparecimento de lesões ao HPV e, atualmente, estudos epidemiológicos trazem evidências de que HPV é fator necessário mas não suficiente para o desenvolvimento do câncer cervical (INCA, 2014; MS/INCA, 2002). O câncer cervical é o sexto tipo mais comum de câncer na população e o segundo mais comum dentre as mulheres. No Brasil, estima -se que ocorram vinte mil novos casos de câncer cervical por ano (AYRES; SILVA, 2010). O ciclo de infecção do HPV é dependente da diferenciação das células hospedeiras infectadas e da replicação das proteínas celulares (Figura 02) (GALLOWAY; LAIMINS, 2015). No ciclo de vida normal, as células filhas geradas na camada basal param de se dividir e se diferenciam, produzindo queratina. Nas camadas mais externas do epi télio, as células perdem a atividade metabólica. No caso das células da camada basal infectadas com HPV, a divisão celular não para devido à ação das proteínas virais para permitir a replicação viral (FEHRMANN; LAIMINS, 2003) . Quando as células epiteliais iniciam a diferenciação, a região promotora tardia do vírus é ativada levando à expressão de genes tardios. Esta cadeia de eventos permitem o aumento e replicação do genoma dos vírus. Por fim, nas camadas superiores, os genomas colocados nos capsídeos, finalizando a formação da partícula viral com potencial de infectar novas células (HEBNER; LAIMINS, 2006). 41 Figura 2 – Dependente ciclo de vida do Papilomavírus humano Legenda: HPV estabelece infecção persistente nas camadas basais do epitélio celular. A replicação ou amplificação ocorre sob diferenciação nas camadas suprabasais. Fonte: Adaptado de Galloway e Laimins (2015). A resposta imune adquirida é mediada pela c ombinação de mecanismos humorais (anticorpos) e celulares . A resposta imune celular é dependente e coordenada pela ação de diferentes citocinas como (Fator de Necrose Tumoral – alfa) TNF-α, (Interleucina 1) IL -1, IL-6, interferons, dentre outras, produzida s em diversas etapas. Essas citocinas podem ser liberadas por diversas células, como linfócitos T, macrófagos, mastócitos, queratinócitos e células natural killers (NK). A ação conjunta entre as citocinas bem como das células ativadas contribuem na contenção das infecções virais (KUPPER; FUHLBRIGGE, 2004). Neste contexto, TGF-β e TNF-α são potentes inibidores da proliferação de queratinócitos, desempenhando um papel importante no controle do crescimento dessas células. Além disso, TNF-α apresenta atividade antitumoral e antiproliferativa que pode ser um evento importante na regressão de lesões e tumores induzidos pela infeção persistente por HPV (KYO et al., 1994). O HPV apresenta diferentes mecanismos de evasão da reposta imune. Intrinsecamente a intracelularidade viral dificulta a eficácia da resposta imune do hospedeiro. Isso torna-os inacessíveis às células do sistema imune. Assim, os anticorpos são importantes na resposta imune prévia, impedindo a entrada do vírus em novas células e na liberação de partículas das células já infectadas. 42 Como a infecção por HPV não apresenta característica citolíticas, não ocorre o recrutamento de resposta inflamatória satisfatória. Além deste mecanismo, proteínas do HPV podem desregular fatores relacionados à montagem da resposta imune. Isso pode ocorrer ao atuarem na maquinaria de processamento de peptídeos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) ou ainda, ao reprimir a e xpressão da cadeia pesada do MHC de cla sse 1, impedindo a resposta a resposta imune ef icaz (KANODIA; FAHEY; KAST, 2007) . Por fim, HPV pode interferir nas atividades de IL -1 e IL -6, além da atividade antiproliferativa e antitumoral de TNF -α sendo esta uma p eça chave na patogênese do vírus no câncer cervical (BOCCARDO et al., 2004; BOCCARDO et al., 2010). 2.2.2 Neisseria gonorrhoeae O médico alemão Albert Neisser foi o primeiro a descrever a N. gonorrhoeae em 1879. Neisserias são cocos gram-negativos, aeróbios, com 0,6 a 1,0 µm de diâmetro e dispostas em pares (diplococos) com os lados adjacentes e achatados. São móveis, possuem pili, não formam esporos, são oxidase e catalase positivas . A espécie N. gonorrhoeae utiliza a gli cose como fonte de carboidrato por meio da oxidação, exige meios complexos para o crescimento, sendo prejudicado pela exposição à baixa umidade e/ou a ácidos graxos. Todas as cepas de N. gonorrhoeae necessitam de cistina e fonte de energia (ex. glicose, piruvato ou lactato) para o crescimento. M uitas cepas necessitam da adição de suplementos como aminoácidos, purinas, pirimidinas e vitaminas. A temperatura ótima de crescimento é de 35 ⁰C a 37 ⁰C, sendo sensível a temperaturas mais baixais. Requer ou se beneficia de atmosfera úmida com 5% de CO2 para o crescimento produzindo colônias de diferentes tamanhos, opacas ou transparentes. A natureza fastidiosa da espécie dificulta o isolamento em espécimes clínicos; no entanto, a bactéria é facilment e transmitida pelo contato sexual. N. gonorrhoeae apresenta diversos fatores de virulência como as proteínas de membrana externa Por, Opa e Rmp responsáveis por promover a sobrevivência, mediar adesão às célula do hospedeiro e proteger, indiretamente, de antígenos, de superfície respectivamente. A variação antigênica da pilina e diferenças antigênicas observadas na proteína PorB fazem com que o indivíduo 43 sofra reinfecções e inviabiliz am o desenvolvimento de vacinas (BHALLA et al., 2007; BIGNELL; UNEMO; EUROPEAN, 2013; CHEN et al., 2013). Neisseria gonorrhoeae, é o agente etiológico da gonorreia ou blenorragia em humanos, uma infecção sexualmente transmissível (IST) (WIESNER; THOMPSON, 1980). Pode ser transmitida por meio do sexo urogenital, anorretal ou oral desprotegido (KOEDIJK et al., 2012). Podem atacar as mucosas de sítios anatômicos como: trato geniturinário, olhos, reto e garganta, causando supuração aguda que pode levar à invasão tecidual. Em hom ens, geralmente ocorre uretrite, com pu s de aspecto cremoso e amarelado , além de micção dolorosa, entretanto, a infecção uretral pode ser ainda assintomática. Em mulheres, a infecção primária é observada na endocérvice e estende-se à uretra e à vagina, resultando em corrimento mucopurulento. Pode ainda progredir para as tubas uterinas, causando salpingite, fibrose e obliteração das tubas. A oftalmia neonatal caracterizada por infecção ocular purulenta pode ocorrer em recém- nascido após o parto (ASHSHI et al., 2015; FASTRING et al., 2014; GUY et al., 2014). Em 2008, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que 106 milhões de casos de gonorreia entre adultos em todo o mundo. Contudo, é válido ressaltar que em diversos países o número é subnotificado por não ser um agravo de notificação, como no Brasil (UNEMO; SHAFER, 2014) . Atualmente, chama a atenção não apenas o número crescente de novos casos de gonorreia pelo mundo, mas também, o aumento da resistência antibiótica apresentada por estes (GRAD et al., 2016; UNEMO; SHAFER , 2014) . Diante desta situação preocupante, planos de controle da disseminação e do impacto da resistência antibiótica tem sido proposto pela OMS (WORKOWSKI et al., 2015). 2.3 Endometriose A endometriose é uma desordem ginecológica crônica comum, benigna, estrógeno-dependente e associada a dor pélvica e infertilidade (ACIEN; VELASCO, 2013; GIUDICE; KAO, 2004) . É caracterizada pela presença de tecido endometrial fora do útero – principalmente no peritônio pélvico, mas também nos ovários e no septo retovagi nal, e mais raramente no pericárdio, pleura e no cérebro (GIUDICE; KAO, 2004). Acomete aproximadamente 10-15% 44 das mulheres em idade reprodutiva e 30-50% das mulheres inférteis (ACIEN; VELASCO, 2013; ESKENAZI; WARNER, 1997). A endometriose é responsável so zinha por mais de 100.000 histerectomias por ano nos Estados Unidos. Os custos anuais em saúde atribuídos à doença chegam a mais de 1 bilhão de dólares por ano. Diante de tal cenário, a endometriose pode ser entendida como uma “doença social” pois afeta a qualidade de vida e a reprodução. Além disso, representa não apenas custos para o diagnóstico e o tratamento, mas também, por seu impacto socioeconômico ao diminuir a produtividade das pacientes (SIGNORILE; BALDI, 2010). 2.3.1 Quadro Clínico O quadro clínico da paciente com endometriose é bastante variável. Algumas pacientes portadoras de endometriose podem ser assintomáticas, no entanto, a maioria apresenta queixas clínicas em diferentes intensidades, como dismenorreia, dor pélvica crônica, infertilid ade, dispareunia de profundidade, sintomas intestinais e urinários cíclicos como dor ou sangramento ao evacuar/urinar durante o período menstrual e fadiga crônica (BELLELIS et al., 2010; NACUL; SPRITZER, 2010) . Dentre outros fatores, a eventual inespecificidade do quadro clínico e a falta de correlação entre sintomas e gravidade da doença podem explicar a demora no diagnóstico da endometriose (BELLELIS et al., 2011) . Relatos indicam que a demora no diagnóstico pode chegar, na média, a 11 anos devido, princi palmente à variação dos sinais e sintomas e a confusão com outras desordens. Neste contexto, o padrão outro para o diagnóstico da doença pélvica ainda é o procedimento cirúrgico - laparoscopia ou laparotomia (GIUDICE; KAO, 2004). Contudo, é válido ressaltar que Abrão et al. , (2007), ao avaliarem a acurácia da ultrassonografia pélvica transvaginal, como método diagnóstico, demonstraram sensibilidade de 94% e especificidade de 98% na identificação de focos de endometriose profunda. Neste exame, se não forem observadas lesões, a paciente pode não ter endometriose ou ter doença inicial não -infiltrativa. Uma ferramenta útil para avaliar a severidade dos sintomas é a escala analógica visual da dor a qual é 45 graduada de zero a 10 para mensurar a dor referida nos si ntomas mais comumente associados à endometriose (ACIEN; VELASCO, 2013). 2.3.2 Epidemiologia da Endometriose Os avanços na epidemiologia da endometriose foram durante muito tempo mascarados por outras doenças e por problemas metodológicos relacionados à definição e seleção do grupo controle. Apesar disso, um perfil mais bem definido da epidemiologia tem emergido nas últimas décadas. Estima- se que a prevalência chegue a 10% na população em geral. Neste contexto, tem- se uma impressão clínica de que a raç a/cor preta tem taxas menores de endometriose e os orientais (raça/cor amarela) tem taxas maiores que a raça/cor branca. Além destes, uma variedade de fatores de risco para endometriose tem sido descrita. Mulheres com endometriose podem ser mais altas e mais magras. Fatores menstruais podem incluir dismenorreia, menarca precoce (≤ 11 anos) e ciclos menstruais mais curtos (≤ 27 dias). Fatores ligados do estilo de vida, associados ao risco diminuído como o tabagismo e exercícios e associados ao risco aumentado como cafeína, etilismo, Índice de Massa Corporal (IMC). Por fim, a idade (> 30 anos), nuliparidade ou reduzida paridade e a história familiar como fatores de risco para a doença (ABRÃO et al., 2007; CRAMER; MISSMER, 2002; OZKAN; MURK; ARICI, 2008; PARAZZINI et al., 2016). 2.3.3 Classificação da endometriose A endometriose pode ser classificada de acordo com o tipo histológico dos implantes, com a localização anatômica da doença – peritoneal, ovariana ou profunda – ou pela extensão da doença sobre os órgãos pélvicos. Além destas, a classificação mais utilizada atualmente é a da American Society of Reproductive Medicine (ASRM) – revisada em 1996. A classificação gradua a endometriose em mínima (Estádio I), leve (Estadio II), moderada (Estadio III) ou grave (Estadio IV) pela extensão da doença no peritônio e ovários, bem como pela presença de aderências tubo -ovarianas e bloqueio do fundo de saco de Douglas. Essa classificação, embora tenha limitações, é bastante útil na 46 orientação do tratamento pós -cirúrgico, especialmente quando a queixa da paciente é a infertilidade. A classificação histológica da endometriose proposta por Abrão et al., (2003) baseia-se em quatro padrões morfológicos: (1) Padrão estromal: presença de estroma morfologicamente similar ao do endométrio tópico em qualquer fase do ciclo; (2) Padrão glandular bem diferenciada: presença de epitélio superficial ou constituindo espaços glandulares ou císticos, composto por células epiteliais com morfologia indistinguível dos endométrios tópicos nas diferentes fases do ciclo menstrual; (3) Padrão glandular indiferenciado: presença de epitélio superficial ou constituindo espaços glandulares ou císticos, sem características morfológicas vistas no epitélio endometrial tópico; (4) Padrão glandular misto de diferenciação: presença, na mesma localização, de epitélios com padrão bem diferenciado e indiferenciado (Figura 3). Figura 3 – Padrões histológicos da endometriose Legenda: a. Foco de endometriose estromal em meio fibrose (Hematoxilina eosina, HE – 100x); b. Foco de endometriose, padrões estromal e glandular bem diferenciado (HE – 400x); c. Endometriose de padrões est romal e glandular indiferenciado (HE – 400x); d. Endometriose de padrões estromal e glandular misto de diferenciação (HE – 100x). Adaptado de: Podgaec, 2006 47 2.3.4 Teorias da Endometriose Diferentes teorias têm sido propostas para explicar a endometriose. Dentre estas estão: (1) Teoria da metaplasia celômica (Teoria de Mayer); (2) Teoria da Implantação de Sampson (crescimento do endométrio após a menstruação retrógrada) e (3) Teoria da Indução. A teoria de Mayer propõe que a endometriose se estabeleça por meio da transformação celular hormônio - dependente das células peritoneais em células do tipo Mulleriano. De acordo com a teoria da implantação, no fenômeno da menstruação retrógrada o tecid o endometrial fluiria através das tubas de falópio até alcançar a cavidade peritoneal. Ao alcançar este sítio anatômico o tecido endometrial pode se implantar e crescer. Finalmente, a teoria da indução é uma combinação das duas primeiras teorias e propõe q ue fatores biomecânicos e imunológicos induzem células indiferenciadas para diferenciadas em tecido endometrial (AUGOULEA et al., 2012; SAMPSON, 1927; VINATIER et al., 2001). Neste contexto, a teoria da menstruação retrógrada (Teoria de Sampson) é a mais aceita para explicar a patogênese da endometriose (SIGNORILE; BALDI, 2010). Diversos pontos argumentam a favor desta teoria: (1) o refluxo de células endometriais durante a menstruação é um fenômeno quase universal quando as tubas uterinas são saudáveis; (2) a localização das lesões de endometriose ocorrem na maioria das vezes próximos da extremidade das tubas uterinas; (3) As células endometriais expressam adesinas e integrinas em sua superfície permitindo sua adesão ao peritônio; (4) o endométrio produz fatores angiogênicos essenciais para a neovascularização local (VINATIER et al., 2001). Contudo, é possível afirmar que a endometriose é uma doença multifatorial com características multifacetadas e, portanto, todas as teorias sobre a sua patogenia devem s er complementares uma à outra, não sendo mutuamente exclusivas (BELLELIS et al., 2011; SIGNORILE; BALDI, 2010) . Diferentes aspectos da doença continuam sendo alvo de pesquisa, destacando -se a busca pela etiopatogenia, tendo em vista que ao se entender o mo tivo do desenvolvimento do foco de endometriose seria possível direcionar esforços para melhorar o diagnóstico e tratamento (BELLELIS et al., 2011; SIGNORILE; BALDI, 2010). 48 2.3.5 Sistema imune e endometriose A teoria da menstruação retrógrada explica a maior parte dos fenômenos associados à patogênese da doença. Contudo, se este é um fenômeno comum e que ocorre na maior parte das mulheres por que apenas cerca de 10% desenvolve a doença? Duas hipóteses para a progressão da doença foram postuladas: (1) A nomalias intrínsecas do endométrio eutópico desenvolve resistência à eliminação pelas células imunes peritoneais e (2) a doença é uma consequência da função alterada de macrófagos e células natural killer (NK), as quais são incapazes de eliminar os implant es endometrióticos. A relação entre estas duas hipóteses não está clara; estas são provavelmente interdependentes (ACIEN; VELASCO, 2013; KRALICKOVA; VETVICKA, 2015). O sistema imune pode desempenhar papel importante na iniciação e progressão da doença. Em particular, linfócitos T e B e células Natural Killer (NK) parecem desempenhar um papel essencial na rejeição ou não do processo de sobrevivência, implantação, e proliferação do endométrio ectópico (OLOVSSON, 2011). Estudos têm mostrado uma atividade red uzida de células T CD8+ e NK, secreção de citocinas por células T auxiliares, e produção de auto-anticorpos por linfócitos B em mulheres com endometriose (BERBIC; FRASER, 2011; OSUGA et al., 2011; SIKORA; MIELCZAREK -PALACZ; KONDERA -ANASZ, 2011) . Contudo, em outro estudo recente realizado por Dias et al., (2012) com mulheres brasileiras, foi observada alta porcentagem de células NK no sangue periférico com endometriose profunda (estágios III e IV), ampliando o debate sobre o assunto quando em discordância com outros dados da literatura. Além disto, tem sido demonstrado que as interações imuno -endócrinas dos indivíduos podem estar envolvidas na patogênese da endometriose (OLOVSSON, 2011). Neste contexto, a maioria dos estudos indicam que as células NK periféricas e as não periféricas apresentam baixa citotoxicidade nas mulheres com endometriose. Estas células aumentam a expressão de receptores inibidores de morte. Estes receptores interagem com HLA -1 de potenciais células-alvo e sofrem a supressão de sua atividade. A atividade dos linfócitos T também está diminuída devido a ativação dos mecanismos de apoptose via Fas- FasL expresso por células endometrióticas e o alto nível da mesma molécula n forma solúvel (HERINGTON et al., 2011). 49 Com a função celular do sistema imune deficiente, a produção de citocinas e quimiocinas por diferentes células podem favorecer a progressão da doença em detrimento da prevenção. Neste contexto, IL -1 apresenta resu ltados conflitantes quando comparados grupos com e sem endometriose. IL-6, por sua vez, pode estar aumentada no soro e ser produzida por células estromais do endométrio em resposta a hormônios e a ativadores imune como IL -1α ou β, TNF-α ou β e IFN-γ. A Interleucina 8 (IL-8) pode desempenhar papel crucial no crescimento da endometriose por ser uma potente angiogênica. MCP -1 (Monocyte Chemotactic Agent) é produzida por várias células e estimula macrófagos maduros a secretarem fatores de crescimento e citocina s que promovem a proliferação de células endometriais. A MCP -1 apresenta alta concentração no fluido peritoneal e está relacionada com a severidade da doença. RANTES, potente quimioatrator para monócitos, macrófagos e linfócitos T, in vitro , foi secretado em maior quantidade por endometriomas quando comparado a células normais do endométrio. Alguns autores têm demonstrado que TNF -α tem concentrações elevadas no soro e no fluido peritoneal de paciente com EDT e que as concentrações encontradas se correlacion am com a severidade da doença (HERINGTON et al., 2011). Citocinas, como IL-12 podem apresentar-se em níveis elevados no líquido peritoneal de pacientes com endometriose em estágios mais avançados, quando comparado com mulheres em estágios iniciais. Isto s ugere uma modulação do perfil Th1 de resposta imunológica, ou seja, pode interferir diretamente no desenvolvimento da endometriose (FAIRBANKS et al., 2009) . Outros trabalhos sugerem que quando dados clínicos específicos associam -se a uma produção elevada de certas citocinas, ocorre um padrão de resposta Th1 que pode estar associado à endometriose profunda (PODGAEC et al., 2010). Contudo, apesar da predominância de um perfil de resposta celular Th1, existem indícios da mudança de perfil para uma reposta humo ral devido uma alta produção de citocinas do perfil Th2 em mulheres com endometriose (PODGAEC et al., 2007). 2.3.6 Microrganismos patogênicos e endometriose Crescente número de evidências sugere que fatores genéticos e de estilo de vida, exposições ambientais, idade, dentre outras características podem ter 50 um papel importante nos mecanismos etiopatogênicos da endometriose (OZKAN et al., 2008) . Embora 70 a 90% das mulheres apresentem menstruação retrógrada, apenas uma minoria irá desenvolver a doença. Isso sugere que outros fatores – genéticos, hormonais ou ambientais – poderiam determinar uma maior suscetibilidade para desenvolver a doença (BELLELIS et al., 201 1; STEFANSSON et al., 2002). Recentemente, tem aumentado o interesse de diferentes pesquisadores em explorar a relação entre a patogênese da endometriose e a possível participação de microrganismos neste complexo processo (KHAN et al., 2010; KHAN et al., 2014; KHAN et al., 2015; KHAN et al., 2016 ; KOBAYASHI et al., 2014). Nos últimos anos, hipóteses que propõe uma teoria infecciosa como fator associado à etiopatogênese da endometriose foram propostas. O primeiro trabalho a sugerir tal relação foi publicado por Kodati et al., (2008). Neste estudo, os autores isolaram RNAm de tecidos eutópicos e ectópicos de casos confirmados de endometriose. Realizaram então PCR por transcriptase reversa utilizando sete diferentes conjuntos de primers arbitrário s e obtiveram ao final apenas uma única banda em tecido endometriótico eutópico. Após sequenciamento, o material foi colocado na plataforma BLAST e a sequência encontrada revelou uma região de 60/65pb correspondendo a 96% de homologia com DNA de Shigella. Com o resultado os autores sugeriram nova possibilidade para a etiologia da endometriose. Neste caso, a bactéria não -móvel passaria entre as células do cólon por meio do mecanismo único chamado polimerização F-actina, alcançando a lâmina própria da mucosa do cólon. Os autores cogitaram que pelo mesmo mecanismo a bactéria possa chegar à corrente sanguínea ou ainda percorrer através da parede do cólon e, assim, alcançar a superfície peritoneal externa do cólon, a qual está em proximidade com o fundo de saco de Douglas. Os autores também propuseram que a reação peritoneal a esta invasão bacteriana possa ser similar a qualquer resposta antigênica do sistema imune do hospedeiro. O resultado deste processo seria a ativação de macrófagos e produção de citocinas características da resposta à inflamação aguda. As células endometriais que são extravasadas durante a menstruação retrógrada no fundo de saco de Douglas ade ririam à superfície peritoneal e ovariana sob influência dos hormônios circulantes, progredindo para e ndometriose por meio da angiogênese. Por fim, os autores postulam que Shigella ou microrganismos 51 similares a Shigella possam ser o gatilho para as mudanças imunológicas no peritônio pélvico as quais iniciam a etiogênese da endometriose. Além da já conhecid a teoria da implantação descrita por Sampson, Vestergaard et al. , (2010) também sugeriram que fatores adicionais que aumentem a susceptibilidade à endometriose devam existir e, neste contexto, fatores imunológicos isolados ou em associação com infecção viral possam estar envolvidos. Os autores analisaram a prevalência de HPV em 52 mulheres. Destas, no grupo caso (n =32) foram incluídas mulheres com endometriose (lesões eutópicas e ectópicas). No grupo controle (n =20), mulheres sem endometriose e que fizera m histerectomia. Esfregaços do colo do útero de ambos os grupos e amostras de tecido ectópico e eutópico foram analisados para a presença de HPV por meio da PCR convencional. Os autores observaram que 3% das mulheres com endometriose foram PCR -positiva para HPV e que 10% das mulheres sem endometriose foram PCR -positivas para HPV. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p = 0.33). O uso da PCR convencional para detecção do HPV pode ter contribuído para a baixa prevalência encontrad a o que certamente compromete uma análise mais consistente. Outro microrganismo de interesse genital também tem sido relacionado com endometriose seria a C. trachomatis. Gazvani et al., (2011) citando dados de trabalho próprio , ainda não publicado, reportaram alta prevalência de anticorpos no líquido intraperitoneal e no soro para C. trachomatis em mulheres com endometriose (38%) quando comparado com controles (19%). Baseado nesta observação, estes autores lançaram a hipótese de que a C. trachomatis poderia estar envolvida na patogênese da endometriose. Estes autores acreditam que a presença da C. trachomatis, ao induzir uma resposta inflamatória no hospedeiro, poderia gerar um ambiente favorável à gênese da endometriose, se não em todos, pelo menos em alguns casos. Os trabalhos realizados por Gazvani et al., (2011), Kodati et al., (2008) e Vestergaard et al., (2010), apesar de introduzirem a problemática, não oferecem bases mais sólidas de observação. Sobretudo pois não são encontradas continuidades dos trabalhos na literatura. Nesse contexto, os trabalhos publicados nos últimos 6 anos por Khan et al., (2010); Khan et al., (2014); Khan et al. , (2015) e Khan et al. , (2016) demonstram de forma mais consistente o 52 propósito de se avaliar quais as implicações provocadas pelos microrganismos no contexto da endometriose. O trato genital inferior está exposto à colonização por vários microrganismos, os quais podem ascender e infectar o trato genital superior por meio da migração (DEB et al., 2004; LARSEN; GALASK, 1980; WIRA et al., 2005). Com base nesta ideia a “teoria da contaminação bacteriana ou infecciosa” emergiu propondo que a ativação bacteriana via LPS/TLR -4 podem levar à inflamação pélvica em endometriose, aumentando lesões e sintomas (KHAN et al., 2010) . Neste trabalho, estes autores encontraram altas concentrações de Escherichia coli , Gardnerella sp., alpha-Streptococcus e Enterococci em amostras de endométrio de mulheres com endometriose, e subsequente alto nível de endotoxina. Em outro estudo, Khan et al. , (2014) avaliaram o risco colonização intrauterina e concorrente ocorrência de endometrite em mulheres com endometriose. Amostras de muco vaginal e endométrio foram coletadas de mulheres com e sem endometriose. Foi observado aumento da colonização intrauterina e concorrente endometrite em mulheres com endometriose, sendo ainda maior naquelas mulheres que f oram tratadas previamente com agonista de GnRH (GnRHa). Os achados sugerem uma alta propensão à endometrite após o tratamento hormonal, bem como uma infecção subclínica. Neste contexto, em seu trabalho mais recente, Khan et al. , (2016) reforçam o argument o de que microrganismos presentes na cavidade uterina podem levar a uma infecção subclínica no ambiente intrauterino e no endometriomas de ovário. Estes autores propõem como possível explicação para seus achados que a menstruação retrógrada seja o fenômeno que permitiu carrear microrganismos até os ovários. Microrganismos intrauterinos podem ser críticos na iniciação da endometriose. A ativação inicial dos receptores de reconhecimento de patógenos (RRP) por estímulo microbiano resulta na ativação de vias p ró- inflamatórias e da imunidade inata. Somado à resposta a vários padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), os receptores Toll-like também reconhecem um amplo leque de padrões moleculares associados a danos (DAMPs). A expressão aumentada dos níve is de DAMPs pode estar envolvido em um subsequente processo de transcrição nuclear dependente do fator -kβ (KOBAYASHI et al., 2014). 53 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral  Detectar a presença de Mollicutes (M. genitalium , M. hominis , U. urealyticum e U. parvum), Papilomavírus humano (HPV) e N. gonorrhoeae em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e biópsia de lesão de endometriose de mulheres com endometriose e de peritônio pélvico sadio de mu lheres sem endometriose para avaliar a associação entre a presença destes agentes infecciosos e a endometriose. 3.2 Objetivos específicos  Detectar, por meio de método molecular (PCR e qPCR) , Mollicutes (M. genitalium, M. hominis , U. urealyticum e U. parvum ) HPV e N. gonorrhoeae em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e biópsia de lesão de endometriose de mulheres com endometriose e de peritônio pélvico sadio de mulheres sem endometriose;  Avaliar se os Mollicutes (M. genitalium, M. hominis, U. urealyticum e U. parvum) HPV e N. gonorrhoeae detectados nas amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia têm associação com perfil clínico-demográfico observado na população estudada;  Avaliar se citocinas do perfil Th1/Th2/Th17/Th22 dosadas em amostras de fluido peritoneal e tecido de biópsia apresentam perfil alterado devido à endometriose e/ou associado à presença de Mollicutes.  Analisar o perfil de expressão gênica, por meio da qPCR array, de vias de resposta imune em amostras de fluido peritoneal e de biópsia de lesão de mulheres com e sem endometriose, infectado ou não pelos microrganismos estudados; 54 4 PACIENTES E MÉTODOS 4.1 Pacientes 4.1.1 Locais do estudo e pacientes O estudo foi desenvolvido no Setor de Endometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) e no Hospital Sírio -Libanês (São Paulo). De agosto de 2014 a agosto de 2015, foram incluídas no estudo 104 pacientes de forma prospectiva, e que foram divididas em dois grupos: Grupo Caso (n = 73), constituído de pacientes com endometriose e Grupo Controle (n = 31), formado por mulheres sem a doença. O total de paciente foi determinado baseando-se, em um cálculo amostral, onde foram considerados os seguintes parâmetros: a) prevalência em dados, de estudo piloto, relacionando colonização de micoplasmas em mulheres com endometriose; b) precisão de 5%; c) nível confiança de 95%; e d) 10% de perdas. Além disso, a obtenção de dados e

clínico esteve condicionado à demanda e rotina de atendimento das duas unidades hospitalares e equipes médicas responsáveis. As atividades desenvolvidas nos hospitais junto às equipes de saúde foram conduzidas sob supervisão do Prof. Dr. Maurício Simões Abrão. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Instituto de Ciências Biomédicas conforme parecer nº 1170/CEPESH (Anexo A), do Hospital Sírio -Libanês conforme Registro AVAP nº GBC260 (Anexo B) e registrado na Plataforma Brasil conforme parecer nº 550.484 (Anexo C). Todas as pacientes leram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo D). O tipo de cirurgia realizado por cada paciente está sumarizado no Apêndice A. 4.1.2 Critérios de inclusão Os critérios de inclusão do G rupo Caso (com endometriose) foram: Comprovação histológica da endometriose; Ausência de doenças neoplásicas concomitantes, no momento do diagnóstico histológico de endometriose, constatada pela anamnese, exame físico, inspeção cirúrgica e exames 55 subsidiários, quando necessários; Ausência de doenças autoimunes, confirmada por anamnese, exame físico e por exames laboratoriais quando necessário clínicos e exames laboratoriais sugestivos de doença autoimune ; Pacientes deveriam estar no período da menacme; Pacientes que não tivessem utilizado antibioticoterapia até um mês antes da coleta do material. Para o grupo controle, foram adotados os seguintes critérios de inclusão: Comprovação cirúrgica da ausência de lesões de endometriose; Ausência de doenças neoplásicas, diagnóstico negativo para en dometriose constatada pela anamnese, exame físico, inspeção cirúrgica e exames subsidiários, quando necessários; Ausência de sinais clínicos e exames laboratoriais sugestivos de doença autoimune ; Pacientes deveriam estar no período da menacme; Pacientes com indicação de cirurgia por videolaparoscopia ; Pacientes que não tivessem utilizado antibioticoterapia até um mês antes da coleta do material. 4.1.3 Quadro clínico Todas as pacientes foram questionadas quanto à presença de seis sintomas associados à endometriose, sendo estes: a. Dismenorreia: dor em cólica no período menstrual, considerada para o estudo somente de intensidade severa, quando a paciente referia que a dor não melhorava completamente com analgésicos, mas não a impedia de exercer suas atividades habituais ou incapacida de, quando a paciente referia que a dor a impedia de exercer suas atividades habituais (LAUFER; GOLDSTEIN, 1998); b. Dispareunia de profundidade: dor pélvica durante a relação sexual; c. Dor pélvica acíclica: dor pélvica sem relação com o ciclo menstrual por menos de seis meses, sem melhora com a utilização de analgésicos; d. Infertilidade: dificuldade para engravidar em casal com vida sexual ativa (duas ou mais relações sexuais por semana) e sem utilizar método contraceptivo por pelo menos um ano; e. Alterações intes tinais cíclicas: sintomas intestinais durante o período menstrual, incluindo aceleração ou diminuição do trânsito intestinal, dor à evacuação, puxo, tenesmo e/ou sangramento nas fezes. f. Alterações urinárias cíclicas: sintomas urinários durante o período menstrual, incluindo disúria, hematúria, polaciúria e/ou urgência miccional. 56 Todos os quadros álgicos tiveram sua intensidade avaliada de acordo com a escala analógica da dor (EAD) (Anexo E). As notas da EAD de 1 a 6 (< 7) foram consideradas para dores leves ou moderadas e as notas de 7 a 10 (≥ 7) para dores severas (CHAPRON et al., 2012) . Além disso, questionários para avaliação de c aracterísticas demográficas , hábitos e características clínicas foram aplicados a cada paciente (Apêndice B e Anexo F). 4.1.4 Estadiamento da Endometriose As pacientes com endometriose tiveram sua doença classificada durante o procedimento cirúrgico pelos critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASRM), revisado em 1996 (Figura 4), em estádios de I a IV. 57 Figura 4 – Estadiamento da endometriose prop osto pela American Society for Reproductive Medicine - ASRM (1996). Usar em caso de trompas e ovários normaisE D Usar em caso de trompas e ovários anormaisE D * Se as fímbrias tubárias estiverem totalmente envolvidas por aderências, mude o escore para 16. Porcentagem de implantes: Lesões vermelhas (claras, vermelhas, rosadas, em chama, vesículas): ___% Lesões brancas (brancas, amareladas, marrons, defeitos de peritônio): ___% Lesões pretas (pretas, depósitos de hemossiderina, azuis): ___% Endometriose adicional: _________________________________________ Patologias associadas: __________________________________________ Estádio I (mínima): 1 – 5 pontos Estádio II (leve): 6 – 15 pontos Estádio III (moderada): 16 – 40 pontos Estádio IV (severa): > 40 pontos PERITÔNIO ENDOMETRIOSE 3 cm Superficial 1 2 4 Profunda 2 4 6 OVÁRIO D Superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 E superficial 1 2 4 Profunda 4 16 20 OBLITERAÇÃO DO FUNDO DE SACO POSTERIOR Parcial Completa 4 20 OVÁRIO ADERÊNCIAS 2/3 Envolvidos D Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 E Velamentosa 1 2 4 Densa 4 8 16 TROMPA D Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 E Velamentosa 1 2 4 Densa 4* 8* 16 58 4.1.5 Locais da doença As lesões de endometriose foram também avaliadas quanto ao sítio mais severo de endometriose peritônio, ovário e/ou em localização infiltrativa profunda, que inclui região retrocervical, vagina, reto -sigmoide, íleo, apêndice, ureter e bexiga. Os locais de comprometimento foram considerados observando- se critérios de severidade do processo, ou seja, doença profunda mais grave que a ovariana, que por sua vez é mais grave que a doença peritoneal. Assim, foram atribuídos como critérios para se considerar doença peritoneal, a existência de focos peritoneais exclusivos, sem a presença de doença profunda e em ovários. A doença ovariana foi determinada na ausência da doença profunda, independente de focos peritoneais . Para a doença profunda, não houve restrições pela presença de endometriose peritoneal ou ovariana. 4.2 Coleta de amostras e processamento em laboratório 4.2.1 Swab endocervical Para obtenção de swab endocervical de cada paciente, foram utilizados espéculos estéreis de forma asséptica. Durante a coleta evitou -se a fricção do swab no introito vaginal. Os swabs foram acondicionados em 5 mL de meio de transporte (BUSOLO et al. , 1981) e mantidos sob refrigeração (4 °C) até o processamento em laboratório. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas em vórtex (15 segundos), divididas em alí quotas (1 mL) em microtubos e, por fim, armazenadas sob refrigeração (-20 °C) até o momento do uso. 4.2.2 Fluido Peritoneal O fluido intraperitoneal foi colhido no início da cirurgia laparoscópica do fundo do saco de Douglas e de outras regiões do assoalho pélvico. De forma asséptica, as amostras foram imediatamente aliquotadas em microtubos estéreis de criopreservação, prontamente armazenados em nitrogênio líquido. As amostras foram mantidas congeladas até o processamento em laboratório. No 59 laboratório, as amostras de fluido peritoneal foram processadas e armazenadas de acordo com a sua finalidade. A alíquota destinada aos testes de detecção de microrganismos por meio da PCR quantitativa em tempo real foi armazenada a - 80 °C até o momento do uso. A alíquota destinada à dosagem de citocinas foi, inicialmente, centrifugada a 20 600 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi acondicionado em novos microtubos estéreis até o uso. O pellet obtido na centrifugação, por sua vez, foi homogeneizado em 1 mL com sol ução tampão estéril RNA Later ® (Ambion, Inc., Austin, TX) e armazenado até o uso para análises de expressão gênica. 4.2.4 Lesão de Endometriose As amostras de lesão de endometriose (peritoneal, ovariana ou profunda) ou peritônio sadio foram acondicionad as em microtubos estéreis de criopreservação imediatamente após a remoção cirúrgica, ainda na sala de cirurgia. Antes de serem armazenados, os tecidos foram divididos de forma asséptica em três partes. As partes, armazenadas separadamente, foram acondicionadas em nitrogênio líquido até processamento. No laboratório, as amostras destinadas a dosagem de citocinas foram maceradas em tampão inibidor de protease (20 mM Tris -HCl, 150 µM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 1 µg/mL pepstatina, 1 mM PMSF – pH 7,5) centrifugada a 20 600 x g por 5 minutos e colhido o sobrenadante. As amostras destinadas à análise de expressão gênica foram conservadas em tampão RNA later (Ambion, Inc., Austin, TX). As amostras destinadas à detecção de microrganismos por PCR em tempo real foram conservadas igualmente em tampão RNA later até o uso. Todas as amostras foram armazenadas em freezer (- 80 °C) até o momento do uso. 4.3 Padronização das cepas utilizadas Para controle positivo dos test es moleculares, foram cultivadas quatro cepas de micoplasmas (M. hominis ATCC 23114 - PG-21, M. genitalium ATCC 33530 - G37, U. urealyticum T960 - sorotipo 7 e U. parvum ATCC - sorotipo 3). As cepas foram obtidas do Laboratório de Micoplasmas ICB/USP. Os meios de cultivo SP4 (TULLY, 1993) e UB (RUHNKE; ROSENDAL, 1994) foram utilizados 60 nos subcultivos das cepas de referência de Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. respectivamente. Os microrganismos foram subcultivados inoculando-se em meios sólidos e líquidos (50 mL), incubados a 37 °C em condições de aerobiose. O controle do crescimento foi realizado pela observação de mudança de cor no meio líquido, acrescido de indicador de pH (vermelho de fenol), resultante da hidrólise da arginina ou fermentação da glicose. No meio sólido , observou-se a produção de pequenas colônias em forma de “ovo frito”. 4.4 Extração de DNA O DNA genômico das cepas de referência e das amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e lesão de endometriose foram obtidas segundo protocolo do kit Invitrogen PurelinkTM Genomic DNA Kits (Invitrogen, São Paulo, S.P., Brasil), baseado na utilização de coluna de sílica. 4.5 Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) 4.5.1 Reação de controle interno da qualidade do DNA Foi realizada PC R utilizand o primers G73/G74 para o gene β -globina, utilizado como controle interno da qualidade do DNA extraído (CAMPOS et al., 2008). Os parâmetros da reação foram 1x de buffer; 0,2 mM de dNTP, 2 mM de MgCl2, 0,08 μM dos primers G73 (5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3') e G74 (5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'); 0,5 U de Taq DNA polimerase recombinante, todos da Invitrogen® (São Paulo, S.P., Brasil); 6 μL de DNA e quantidade suficiente de água ultrapura até o volume final d e 25 L. As amplificações foram realizadas em termociclado r, obedecendo a uma desnaturação inicial de 95 °C por 5 minutos, 40 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto, 72 °C por 1 minuto, um ciclo final de 72 °C por 5 minutos e hold step a 4 °C. A corrida foi feita em gel de Agarose 1% corado com 0,3% de Gel RedTM (Biotium®) (CAMPOS et al., 2008). Todas as amostras foram positivas, apresentando boa qualidade para a realização das próximas PCRs. 61 4.5.2 qPCR para detecção de M. genitalium Para re alização da PCR em tempo real para detecção da espécie M. genitalium nas amostras clínicas foram utilizadas placas de 96 poços próprias para realização da técnica, adicionado a cada poço (0,2 mL): 12,5 µL de Master Mix (Applied Biosystems São Paulo, S.P., Brasil), 2,5 µL de primer MgPa-355F (5’-GAGAAATACCTTGATGGTCAGCAA-3’) [10 pmols], 2,5 µL de primer MgPa- 432R (5’ – GTTAATATCATATAAAGCTCTACCGTTGTTATC – 3’) [ 10 pmols ], 0,5 µL de sonda (5’ FAM – ACTTTGCAATCAGAAGGT – MGB 3’) [5 mM], 2 µL de água e 5 ,0 µL de DNA, com volume final de 25 µL. As amostras foram submetidas à amplificação nas seguintes condições de termociclagem: 50 °C por 10 minutos, 95 °C por 10 minutos, seguidos de 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto (OLSEN et al., 2009). A PCR em tempo real foi realizada em duplicata, utilizando a plataforma Applied Biosystems. 4.5.3 qPCR para a detecção de M. hominis Na realização da PCR em tempo real para detecção da espécie M. hominis foram utilizadas placas próprias para realização da técnica, adicionado a cada poço (0,2 mL): 12,5 µL de Master Mix (Applied Biosystems, São Paulo, S.P., Brasil), 0,6 µL de primer MHyidCfwd (5’ – TCACTAAACCGGGTATTTTCTAACAA – 3’) [ 10 pmols ], 0,6 µL de primer MHyidCrev (5’ – TTGGCATATATTGCGATAGTGCTT – 3’) [10 pmols], 0,8 µL de sonda (5’ FAM – CTACCAATAATTTTAATATCTGTCGGTATG – MGB 3’ ) [5 mM], 8,5 µL de água e 2 µL de DNA, com volume final da reação de 25 µL. As amostras foram submetidas à amplificação nas segu intes condições de termociclagem: 50 °C por 10 minutos, 95 °C por 10 minutos, seguidos de 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto (FERANDON et al., 2011). A PCR em tempo real foi realizada em duplicata, utilizando a plataforma Applied Biosystems. 62 4.5.4 qPCR para detecção de U. urealyticum Na realização da PCR em tempo real para detecção da espécie U. urealyticum f oram utilizadas placas próprias para realização da técnica, adicionado a cada poço (0,2 mL): 12,5 µL de Master Mix (Applied Biosystems, São Paulo, S.P., Brasil), 0,75 µL de primer UUureF ( 5’ – ATCGACGTTGCCCAAGGGGA – 3’), 0,75 µL de primer UUureR ( 5’ – TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC – 3’) [10 pmols], 0,5 µL de sonda (FAM – TTGTCCGCCTTTACGAG – MGB) [5 mM], 9,5 µL de água e 1,0 µL de DNA em quantidades suficientes para um volume final de 25 µL. As amostras foram submetidas à amplificação nas seguintes condições de termociclagem: 50 °C por 2 minutos, 95 °C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 58 °C por 30 segundos (CAO et al., 2007). A PCR em tempo real foi realizada em duplicata, utilizando a plataforma Applied Biosystems. 4.5.5 qPCR para detecção de U. parvum Na realização da PCR em tempo real para detecção da espécie U. urealyticum f oram utilizadas placas próprias para realização da técnica, adicionado a cada poço (0,2 mL): 12,5 µL de Master Mix (Applied Biosystems, São Paulo, S.P., Brasil) , 0,75 µL de primer UUU rePF ( 5’ – CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA – 3’), 0,75 µL de primer UU UrePR ( 5’ – TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC – 3’) [10 pmol], 0,5 µL de sonda (FAM – TTGACCACCCTTACGAG – MGB) [5 mM], 9,5 µL de água e 1,0 µL de DNA em quantidades suficientes para um volume final de 25 µL. As amostras foram submetidas à amplificação nas seguintes condições de termociclagem: 50 °C por 2 minutos, 95 °C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 58 °C por 30 segundos (CAO et al., 2007). A PCR em tempo real foi realizada em duplicata, utilizando a plataforma Applied Biosystems. 4.5.6 qPCR para detecção de N. gonorrhoeae Na realização da PCR em tempo real para detecção da espécie N. gonorrhoeae f oram utilizadas placas próprias para realização da técnica, 63 adicionado a cada poço (0,2 mL): 12,5 µL de Master Mix (Applied Biosystems, São Paulo, S.P., Brasil), 0,75 µL de primer NGF (5’ - CCGGAACTGGTTTCATCTGATT - 3’), 0,75 µL de primer NGR (5’ - GTTTCAGCGGCAGCATTCA – 3’) [10 pmol], 0,5 µL de sonda (FAM – CGTGAAAGTAGCAGGCGTATAGGCGGACTT – MGB) [5 mM], 9,5 µL de água e 1,0 µL de DNA em quantidades suficientes para um volume final de 25 µL. As amostras foram submetidas à amplificação nas se guintes condições de termociclagem: 50 °C por 2 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C por 30 segundos e 55 °C por 30 segundos (GEELEN et al., 2013) . A PCR em tempo real foi realizada em duplicata, utilizando a plataforma Applied Biosystems. 4.5.7 Análise dos dados da PCR quantitativa A quantificação dos microrganismos foi realizada por meio de técnica de quantificação absoluta, tomando por base uma curva padrão, previamente estabelecida, variando de 10 7 a 1 cópias de microrganismos/mL. Para cada experimento, uma nova curva padrão foi adicionada e parâmetros de qualidade foram adotados na análise, sendo estes: r2 ≥ 0.950, eficiência da reação variando de 95% a 105% e slope de valor ≈ – 3.32. 4.5.8 PCR para detecção de Papilomavírus humano (HPV) Para detecção de HPV foi realizada PCR utilizando 1x de tampão; 0,2 mM de dNTP; 4 mM de MgCl 2; 1 µM dos primers GP5 ( 5' - TTTGTTACTGTGGTAGATAC - 3') e GP6 (5' - GAAAAATAAACTGTAAATCAT - 3'); 0,5 U de Taq DNA polimerase recombinante, todos da Invitrogen ® (São Paulo, S.P., Brasil); 3 L do DNA e quantidade suficiente de água ultrapura até o volume final de 25 L. Após adição do DNA, as amostras foram levadas para o termociclador sob o programa de 1 ciclo de 94 °C por 5 minutos, 39 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 40 °C por 2 minutos, 72 °C por 1,5 minuto, e um ciclo final a 72 °C por 7 minutos. A corrida foi feita em gel de Agarose 1% corado com 0,3% de Gel RedTM (Biotium®) (GRAVITT et al., 2000; SNIJDERS et al., 1990). 64 4.6 Dosagem de citocinas A dosagem das citocinas, presentes das amostras de líquido intraperitonial e amostras de lesão de endometriose (peritoneal, ovariana ou profunda) ou peritônio sadio, foi realizada por meio do ensaio para detecção por meio da tecnologia para bioensaios multiplex–Luminex com equipamento Bio- Plex 200 system . Foi utilizado o Kit comercial ProcartaPlex® Immunoassay Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh/Treg (18 plex) (eBioscience – Affmetrix, Estados Unidos) para determinação de GM-CSF, IFN-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e TNF-. Ensaios Luminex são baseados na tecnologia xMAP® a qual possibilita a detecção e quantificação de múltiplos alvos de proteínas simultaneamente. O sistema xMAP® combina um citômetro de fluxo, microesferas fluorescentes, lasers e um processamento de sinal digital para permitir a multiplexação eficiente de até 100 ensaios exclusivos em uma única amostra. As dosagens das citocinas foram realizadas de acordo com o fabricante do kit utilizado. Para a normalização dos dados de citocinas, a quantidade obtida foi correlacionada com a quantidade de proteína total das amostras. A dosagem de proteínas totais foi realizada utilizando o kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Brasil) 4.7 Análise de expressão gênica A expressão gênica dos marcadores inflamatórios foi avaliada pela metodologia de PCR array. O mRNA , das células presentes no líquido intraperitoneal e das amostras de lesão de endometriose (peritoneal, ovariana ou profunda) ou peritônio sadio , foi extraído com a utilização do kit TRIZOL® Plus (Thermo Scientific, Brasil), seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. A obtenção do cDNA foi feita por meio de uma retro-transcrição (RT) a partir do mRNA, utilizando -se o kit SuperScript® III Reverse Transcriptase (Thermo Scientific, Brasil) com adição de oligonucleotídeos complementares à cauda poli- A do RNAm (Oligo dT) e inibidor de RNAse. O c DNA obtido foi submetido a análise pelo kit Human Innate & Adaptive Immune Responses PCR Array (Qiagen-SABioscience, Brasil). O kit de qPCR array permite analisar a expressão de 84 genes envolvidos na resposta do hospedeiro à infecção bacteriana (Tabela 65 1). Esse array inclui genes relacionados a sinalização de TLR, bem como, genes envolvidos na resposta de fase aguda, ativação do sistema complemento, resposta inflamatória e resposta imunológica adquirida contra bactérias . Todos os procedimentos e análise de dados foram realizados de acordo com as instruções e software do fabricante. 66 Tabela 1 – Genes avaliados pelo kit Human Innate and Adaptive Immune Responses PCR Array (continua) Símbolo Descrição APCS Amyloid P component, serum C3 Complement component 3 CASP1 Caspase 1, apoptosis-related cysteine peptidase (interleukin 1, beta, convertase) CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2 CCL5 Chemokine (C-C motif) ligand 5 CCR4 Chemokine (C-C motif) receptor 4 CCR5 Chemokine (C-C motif) receptor 5 CCR6 Chemokine (C-C motif) receptor 6 CCR8 Chemokine (C-C motif) receptor 8 CD14 CD14 molecule CD4 CD4 molecule CD40 CD40 molecule, TNF receptor superfamily member 5 CD40LG CD40 ligand CD80 CD80 molecule CD86 CD86 molecule CD8A CD8a molecule CRP C-reactive protein, pentraxin-related CSF2 Colony stimulating factor 2 (granulocyte-macrophage) CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 CXCR3 Chemokine (C-X-C motif) receptor 3 DDX58 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 58 FASLG Fas ligand (TNF superfamily, member 6) FOXP3 Forkhead box P3 GATA3 GATA binding protein 3 HLA-A Major histocompatibility complex, class I, A HLA-E Major histocompatibility complex, class I, E ICAM1 Intercellular adhesion molecule 1 IFNA1 Interferon, alpha 1 IFNAR1 Interferon (alpha, beta and omega) receptor 1 IFNB1 Interferon, beta 1, fibroblast IFNG Interferon, gamma IFNGR1 Interferon gamma receptor 1 IL10 Interleukin 10 IL13 Interleukin 13 IL17A Interleukin 17A IL18 Interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor) IL1A Interleukin 1, alpha IL1B Interleukin 1, beta IL1R1 Interleukin 1 receptor, type I IL2 Interleukin 2 IL23A Interleukin 23, alpha subunit p19 IL4 Interleukin 4 IL5 Interleukin 5 (colony-stimulating factor, eosinophil) IL6 Interleukin 6 (interferon, beta 2) 67 Tabela 1 – Genes avaliados pelo kit Human Innate and Adaptive Immune Responses PCR Array (continua) Símbolo Descrição CXCL8 Interleukin 8 IRAK1 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 IRF3 Interferon regulatory factor 3 IRF7 Interferon regulatory factor 7 ITGAM Integrin, alpha M (complement component 3 receptor 3 subunit) JAK2 Janus kinase 2 LY96 Lymphocyte antigen 96 LYZ Lysozyme MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 MBL2 Mannose-binding lectin (protein C) 2, soluble MPO Myeloperoxidase MX1 Myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon- inducible protein p78 (mouse) MYD88 Myeloid differentiation primary response gene (88) NFKB1 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 NFKBIA Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha NLRP3 NLR family, pyrin domain containing 3 NOD1 Nucleotide-binding oligomerization domain containing 1 NOD2 Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 RAG1 Recombination activating gene 1 RORC RAR-related orphan receptor C SLC11A1 Solute carrier family 11 (proton-coupled divalent metal ion transporters), member 1 STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 (acute- phase response factor) STAT4 Signal transducer and activator of transcription 4 STAT6 Signal transducer and activator of transcription 6, interleukin-4 induced TBX21 T-box 21 TICAM1 Toll-like receptor adaptor molecule 1 TLR1 Toll-like receptor 1 TLR2 Toll-like receptor 2 TLR3 Toll-like receptor 3 TLR4 Toll-like receptor 4 TLR5 Toll-like receptor 5 TLR6 Toll-like receptor 6 TLR7 Toll-like receptor 7 TLR8 Toll-like receptor 8 TLR9 Toll-like receptor 9 68 Tabela 1 – Genes avaliados pelo kit Human Innate and Adaptive Immune Responses PCR Array (conclusão) Símbolo Descrição TNF Tumor necrosis factor TRAF6 TNF receptor-associated factor 6 TYK2 Tyrosine kinase 2 ACTB Actin, beta B2M Beta-2-microglobulin GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 4.8 Análise estatística As informações clínico-epidemiológicas foram analisadas estatisticamente usando o software SPSS 20 .0® (SPSS Inc., Chicago, Estados Unidos). Para verificação de associação entre variáveis foi aplicado o Teste de Qui-quadrado de Pearson. A significância estatística foi con siderada nos casos em que o valor de p < 0,05. O nível de confiança adotado para as conclusões foi de 95%. Para a avaliação dos fatores de risco associados às infecções empregou-se o Odds Ratio (OR) em uma análise univariada. Para comparar as médias de idade entre os grupos caso e controle, após utilizar o teste de Shapiro -Wilk, para checar a distribuição gaussiana (normal) dos dados, foi empregado o teste t-Student. Para anális e dos dados de quantificação do número de cópias dos microrganismos, dosagem de citocinas e expressão gênica foi utilizado o programa GraphPad Prism. Previamente os dados foram analisados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar a distribuição normal ou não dos dados. Foi realizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney, quando avaliados dois grupos. Dados expressos pela Média ± Desvio Padrão (com exceção dos dados de expressão gênica, onde os dados foram gerados e analisados pelo software do kit, sendo apenas usado o GraphPad para representação gráfica dos resultados). A significância estatística foi considerada nos casos em que o valor de p < 0,05. 69 5 RESULTADOS 5.1 Características demográficas da população estudada A Tabela 2 apresenta as características demográficas das pacientes incluídas no estudo, separadas nos grupos caso e controle. A média das idades das mulheres participantes foi de 36,39 anos (mín.: 15 e máx.: 51). A maior parte das mulheres declararam -se brancas (71,2%), casadas (73,0%) e/ou em relacionamento estável (90,4%) e reportaram não saber de casos de endometriose na família (74,4%). A maioria das pacientes (48,8%) se enquadrou no perfil saudável quando avaliado o Índice de Massa Corpórea (IMC: 18,5 – 25,0). Não houve significância estatísticas quando avaliadas as variáveis listadas acima (p > 0,05) (Tabela 2). A maioria das mulheres declarou ter concluído o curso superior (58,2%), e aquelas com endometriose apresentaram grau de instrução estatisticamente maior que as do grupo controle (p = 0,015). Tabela 2 – Características demográficas da população estudada (continua) Características Demográficas Grupo Total (N = 104) Odds Ratio IC 95% p* Endometriose (n = 73) Controle (n = 31) Idade (anos), n (%) Média Mediana (min.; máx.) 35,75 37,90 36,39 0,424ϴ 36,00 (15; 49) 39,00 (26; 51) 36,50 (15; 51) Raça/Cor, n (%) Branca Preta Amarela Parda 55 (75,3) 19 (61,2) 74 (71,2) 1,00 0,095¥ 2 (2,7) 6 (19,4) 8 (7,7) 0,74 [0,24; 2,24] 3 (4,1) 0 (0) 3 (2,9) 6,50 [1,00; 42,17] 13 (17,8) 6 (19,4) 19 (18,3) ND - Grau de Instrução, n (%)1 Superior Nenhum/1º Grau/2ºGrau 39 (66,1) 7 (35,0) 46 (58,2) 10,5 [1,24; 10,5] 0,015† 20 (33,9) 13 (65,0) 33 (41,8) Estado Civil, n (%)2 Casada/Amasiada Separada Solteira Viúva 40 (70,2) 18 (81,8) 58 (73,4) 1,00 0,975¥ 3 (5,3) 0 (0) 3 (3,8) ND - 12 (21,1) 4 (18,2) 16 (20,3) 1,000 - 2 (3,5) 0 (0) 2 (2,5) ND - Relação Estável, n (%)3 Sim Não 44 (86,3) 22 (100) 66 (90,4) 0,66 [0,56; 0,79] 0,163ɸ 7 (13,7) 0 (0) 7 (9,6) 70 Tabela 2 – Características demográficas da população estudada (conclusão) Características Demográficas Grupo Total (N = 104) Odds Ratio IC 95% P* Endometriose (n = 73) Controle (n = 31) IMC (kg/m2), n (%)4 Baixo Peso ( 25,0) 1 (1,6) 2 (9,1) 3 (3,6) 0,96 [0,35; 2,65] 0,351¥ 31 (50,0) 10 (45,5) 41 (48,8) 1,00 30 (48,4) 10 (45,5) 40 (47,6) 6,00 [0,49; 73,45] EDT na Família, n (%)5 Sim Não 17 (27,9) 4 (19,0) 21 (25,6) 1,64 [0,48; 5,58] 0,611† 44 (72,1) 17 (81,0) 61 (74,4) Nota: Perda de observação: 1Grau de Instrução: perda de 25 (n = 79); 2Estado Civil: perda de 25 (n = 79); 3Relação estável: perda de 31 (n = 73); 4IMC (Índice de Massa Corporal): perda de 20 (n = 84); 5EDT prévia na família: perda de 22 (n = 82). *Valor de p em negrito indica significância estatística (p < 0,05). ϴ Teste t-Student † Teste de Qui-quadrado ɸ Teste Exato de Fisher ¥ Razão de Verossimilhança ND: Não definida 5.2 Características clínicas da população estudada Na Tabela 3 podem ser observados os aspectos do perfil clínico e a distribuição das pacientes de acordo com as classificações da doença . De acordo com parâmetros da ASRM (1996), 38 pacientes tinham endometriose em estádios iniciais (I e II) e 35 em estádios avançados (III e IV). Destas pacientes, 33,3% estavam na fase folicular do ciclo menstrual, 36,1% estavam na fase lútea e 30,6% estav am em amenorreia devido ao uso de hormônios. O uso de hormônios pelas mulheres foi mais frequente em pacientes com endometriose quando comparado ao grupo controle (p < 0,001). Dentre os sintomas clínicos avaliados, a intensidade de dor de acordo com a esca la visual analógica de dor (EAD) pelas pacientes para dor pélvica acíclica, alterações intestinais cíclicas e alterações urinárias cíclicas não foi estatisticamente significante ao serem comparados os grupos caso e controle (p > 0,05). A intensidade da dor referida pelas mulheres para os sintomas dismenorreia (p < 0,001) e dispareunia (p < 0,009), foi estatisticamente maior nas mulheres com endometriose do que no grupo controle. A queixa de infertilidade foi estatisticamente associada às mulheres com endometriose (p = 0,014), 71 Tabela 3 – Características clínicas da população estudada e distribuição das pacientes de acordo com as classificações da endometriose Características Clínicas Grupo Total (N = 104) OR IC 95% p* Endometriose (n = 73) Controle (n = 31) Hormônio, n (%)1 Sim Não 39 (54,2) 5 (16,7) 44 (43,1) 5,90 [2,03; 17,16] < 0,001† 33 (45,8) 25 (83,3) 58 (56,9) Fase do Ciclo, n (%)2 Sem Ciclo Folicular Lútea 22 (30,6) 5 (16,1) 27 (26,2) 1,00 0,375¥ 24 (33,3) 17 (54,8) 41 (39,8) 1,96 [0,64; 5,99] 26 (36,1) 9 (29,0) 35 (34,0) 1,08 [0,32; 3,59] Estadiamento (ASRM), n (%) I II III IV 22 (30,1) 22 (30,1) 16 (21,9) 16 (21,9) 9 (12,3) 9 (12,3) 26 (35,6) 26 (35,6) Sítio mais severo de EDT, n (%)ɸ Peritoneal Ovariana Profunda 16 (22,2) 16 (22,2) 3 (4,2) 3 (4,2) 53 (73,6) 53 (73,6) Dismenorreia (EAD), n (%)3 ≥ 7 < 7 53 (80,3) 12 (42,9) 65 (69,1) 5,43 [2,07; 14,24] < 0,001† 13 (19,7) 16 (57,1) 29 (30,9) Dor pélvica acíclica (EAD), n (%)4 ≥ 7 < 7 30 (45,5) 7 (25,0) 37 (39,4) 2,50 [0,93; 6,68] 0,063† 36 (54,5) 21 (75,0) 57 (60,6) Dispareunia (EAD), n (%)5 ≥ 7 < 7 33 (50,8) 6 (21,4) 39 (41,9) 3,78 [1,35; 10,54] 0,009† 32 (49,2) 22 (78,6) 54 (58,1) Alt. intest. cíclicas (EAD), n (%)6 ≥ 7 < 7 18 26,9) 3 (10,7) 21 (22,1) 3,06 [0,82; 11,38] 0,145† 49 (73,1) 25 (89,3) 74 (77,9) Alt. urinárias cíclicas (EAD), n (%)7 ≥ 7 < 7 11 (16,4) 1 (3,6) 12 (12,6) 5,30 [0,65; 43,22] 0,168† 56 (83,6) 27 (96,4) 83 (87,4) Infertilidade (EAD), n (%)8 Sim Não 31 (47,0) 5 (19,2) 36 (39,1) 3,72 [1,25; 11,04] 0,014† 35 (53,0) 21 (80,8) 56 (60,9) Nota: Perda de observação: 1Hormônio: perda de 3 (n = 101); 2Fase do Ciclo/Tipo de EDT: perda de 1 (n = 103); 3Dismenorreia: perda de 10 (n = 94); 4Dor pélvica cíclica: perda de 10 (n = 94); 5Dispareunia: perda de 11 (n = 93); 6Alterações Intestinais: perda de 09 (n = 95); 7Alterações Urinárias: perda de 09 (n = 95); 8Infertilidade: perda de 14 (n = 92). 9Tipo de EDT: perda de 1 (n = 103) Legenda: EAD = Escala Analógica da Dor; EDT = Endometriose *Valor de p em negrito indica significância estatística (p < 0,05). † Teste de Qui-quadrado ¥ Razão de Verossimilhança ɸ O n total refere-se apenas às pacientes com EDT 72 5.3 Hábitos de vida da população estudada Quando analisados os hábitos da população estudada pôde -se observar que sua maioria era composta por mulheres não -fumantes (86,9%), com a vida sexual ativa (91,4%), que reportaram fazer sempre uso de preservativo nas relações sexuais (58,2%) e que tiveram de dois a cinco parceiros sexuais ao longo da vida (54,1%) (Tabela 4). Ao compararmos estes hábitos de vida entre os grupos caso e controle, não encontramos diferença estatística (p > 0,05). Tabela 4 – Hábitos de vida da população estudada Hábitos Grupo Total (N = 104) Odds Ratio IC 95% p* Endometriose (n = 73) Controle (n = 31) Tabagismo, n (%)1 Ex-fumante e Fumante Não fumante 9 (14,5) 2 (9,1) 11 (13,1) 1,69 [0,33; 8,54] 0,779† 53 (85,5) 20 (90,9) 73 (86,9) Vida sexual, n (%)2 Ativa Inativa 59 (88,1) 26 (100,0) 85 (91,4) 0,69 [0,60; 0,79] 0,100ɸ 8 (11,9) 0 (0) 8 (8,6) Uso de preservativo, n (%)3 Sim Não 30 (52,6) 16 (72,7) 46 (58,2) 0,41 [0,14;1,21] 0,105† 27 (47,4) 6 (27,3) 33 (41,8) N parceiros na vida, n (%)4 1 2 – 5 > 5 16 (35,6) 6 (37,5) 22 (36,1) 1,00 0,858¥ 24 (52,3) 9 (56,2) 33 (54,1) 1,87 [0,18; 19,52] 5 (11,1) 1 (6,0) 6 (9,8) 1,87 [0,19; 18,32] Nota: Perda de observação: 1Tabagismo: perda de 20 (n = 84); 2Vida sexual: perda de 11 (n = 93); 3Uso de preservativo: perda de 25 (n = 79); 4Dismenorreia: perda de 15 (n = 89). *Significância estatística quando p < 0,05 † Teste de Qui-quadrado ɸ Teste Exato de Fisher ¥ Razão de Verossimilhança 5.4 Perfil de prevalência dos microrganismos na população estudada A Tabela 5 apresenta a prevalência de cada um dos microrganismos pesquisados nos três tipos de amostra clínica (swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia) , para cada grupo de estudo. Todos os microrganismos-alvo do estudo foram detectados nas amostras de swab endocervical de ambos os grupos. Nas amostras de fluido peritoneal, no grupo caso, quatro microrganismos (M. genitalium, M. hominis, U. urealyticum e HPV) foram detectados, ao passo que no grupo controle apenas dois (M. genitalium e 73 M. hominis). Nas amostras de tecido, foram detectados em ambos os grupos M. genitalium e HPV. Mas, apenas no grupo caso foi detectado também M. hominis. Na tabela 5 o número de amostras analisadas varia devido à falta de amostra clínica para teste. Ao analisarmos as amostras de swab endocervical, a prevalência de M. genitalium, M. hominis , U. urealyticum e HPV foi maior nas pacientes com endometriose (14,1%, 43,7%, 8,5% e 5,9% respectivamente) do que no grupo controle (11,1%, 40,7%, 3,7% e 3,7% respectivamente). De forma similar , nas amostras de fluido peritoneal, as prevalências de M. genitalium, M. hominis, U. urealyticum e HPV, foram maiores no grupo caso (40,7%, 27,8%, 3,7% e 9,6% respectivamente) do que no grupo controle (20,8%, 16,7%, 0% e 0% respectivamente). Nas amostras de tecido de biópsia , as prevalências de M. genitalium (13,2%) e M. hominis (5,9%) foram maiores nas mulheres com endometriose do que naquelas sem a doença (6,7% e 0% respectivamente). Nestas amostras, a prevalência de HPV no grupo controle (3,3%) e caso (3,0%) foi bastante similar (Tabela 5). Ainda na Tabela 5, de forma interessante, observa-se que as prevalências da maioria dos Mollicutes ( M. hominis, U. urealyticum e U. parvum) em cada amostra clínica assumem uma tendência decrescente na ordem Swab > Fluido Peritoneal > Tecido de Biópsia, exceto para M. genitalium . N. gonorrhoeae também apresenta o mesmo perfil quando observado o grupo controle. Por outro lado, assim como M. genitalium , não houve a mesma tendência no perfil de detecção do HPV nas diferentes amostras. 74 Tabela 5 – Perfil de detecção de espécies de Mollicutes (M. hominis , M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum), HPV e N. gonorrhoeae, em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. 5.4.1 Perfil de prevalência dos Microrganismos Vs Uso de hormônios Como houve uso de hormônio por parte das pacientes incluídas no presente estudo, avaliamos se havia associação entre o uso de diferentes tipos de terapia hormonal utilizados pelas pacientes nos três meses anteriores à cirurgia (ACO/Injetável e Sistema Intrauterino Liberador de Levonorgestrel – SIU- LNG) e o perfil de prevalência dos microrg anismos nas amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia. Não foi observada associação estatisticamente significante nas análises (p > 0,05) (Apêndices C, D, E e F). Por fim, é válido ressaltar que nenhuma das mulheres reportou o uso de DIU de cobre. Resultado qPCR Grupo Endometriose Controle Swab (n = 73) Fluido (n = 54) Tecido (n = 68) Swab (n = 31) Fluido (n = 24) Tecido (n = 30) M. genitalium, n (%) Positivo Negativo 10 (14,1) 22 (40,7) 9 (13,2) 3 (11,1) 5 (20,8) 2 (6,7) 61 (85,9) 32 (59,3) 59 (86,8) 24 (88,9) 19 (79,2) 28 (93,3) M. hominis, n (%) Positivo Negativo 31 (43,7) 15 (27,8) 4 (5,9) 11 (40,7) 4 (16,7) (0) 40 (56,3) 39 (72,2) 64 (94,1) 16 (59,3) 20 (83,3) 30 (100) U. urealyticum, n (%) Positivo Negativo 6 (8,5) 2 (3,7) 0 (0) 1 (3,7) 0 (0) 0 (0) 65 (91,5) 52 (96,3) 68 (100) 29 (77,8) 24 (100) 30 (100) U. parvum, n (%) Positivo Negativo 10 (14,1) 0 (0) 0 (0) 6 (22,2) 0 (0) 0 (0) 61 (85,9) 54 (100) 68 (100) 21 (77,8) 24 (100) 30 (100) Micoplasma, n (%) Sim Não 39 (54,9) 29 (53,7) 36 (52,9) 16 (59,3) 8 (33,3) 16 (53,3) 32 (45,1) 25 (46,3) 32 (47,1) 11 (40,7) 16 (66,7) 14 (46,7) HPV, n (%) Positivo Negativo 4 (5,9) 5 (9,6) 2 (3,0) 1 (3,7) (0) 1 (3,3) 64 (94,1) 47 (90,4) 65 (97,0) 26 (96,3) 23 (100) 26 (96,9) N. gonorrhoeae, n (%) Positivo Negativo 0 (0) (0) 0 (0) 2 (6,7) 0 (0) 0 (0) 71 (100,0) 54 (100) 68 (100) 28 (93,3) 24 (100) 30 (100) 75 5.5 Perfil de coinfecção e proporção de microrganismos nos grupos de estudo A coinfecção no presente estudo está definida como a detecção de dois ou mais microrganismos -alvo na mesma amostra clínica. Assim, o perfil de coinfecção dos grupos caso e controle foi analisado e está representado de duas formas. Na primeira forma, apresentada na Figura 5, apenas os Mollicutes foram incluídos. Houve di ferença estatisticamente significante na proporção da coinfecção pelas espécies da classe Mollicutes, entre os grupos caso e controle (p < 0,05). Na segunda análise, apresentada na Figura 6, além dos Mollicutes foram incluídos os demais microrganismos (HPV e N. gonorrhoeae). De forma similar, houve diferença estatisticamente significante na proporção da coinfecção das espécies de microrganismos detectados entre os grupos caso e controle (p < 0,05). Em ambos resultados há maior diversidade de perfis de coinf ecção no grupo caso em relação ao grupo controle nas amostras de swab endocervical e fluido peritoneal (Figuras 5A, 5B, 6A e 6B). A comparação do perfil de coinfecção nas amostras de tecido de biópsia entre os grupos mostra ou um perfil de similaridade entre os grupos (Figura 6C) ou de maior diversidade no grupo caso (Figura 5C). As prevalências das coinfecções, em cada grupo de estudo, por amostra clínica analisada, podem ser observadas na íntegra nos apêndices G, H e I. Nas amostras de swab endocervical, as maiores prevalências foram de M. genitalium e M. hominis (7,7%) e M. hominis e U. parvum (4,8%). Em todos os casos de coinfecção observados nas amostras de swab endocervical, a prevalência foi maior nas mulheres com endometriose quando comparado ao gr upo controle (Apêndice G). Nas amostras de fluido peritoneal, as maiores prevalências ocorreram entre M. genitalium e M. hominis (9%) e M. genitalium e HPV (3,8%). As prevalências de coinfecção também foram maiores no grupo caso quando comparado ao grupo controle (Apêndice H). Ao analisar as amostras de tecido de biópsia, não foi observada predominância das prevalências em nenhum dos grupos (caso e controle) do estudo (Apêndice I). 76 Figura 5 – Proporção de detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Caso Controle 0 50 100 Negativo MH UU UP MG + MH MG + UU MG + UP MH + UU MH + UP MG + MH + UU MG + MH + UP MG + MH + UU + UP P < 0,001 A Porcentagem de mulheres Caso Controle 0 50 100 Negativo MH MG MG + MH MG + MH + UU P = 0,0083 B Porcentagem de mulheres Caso Controle 0 50 100 Negativo MH MG MG + MH P = 0,0007 C Porcentagem de mulheres Legenda: MG: M. genitalium; MH: M. hominis; UU: U. urealyticum; UP: U. parvum. (A) Amostras de swab endocervical; (B) Amostras de fluido peritoneal; (C) Amostras de tecido de biópsia. Comparação de proporções por ANOVA – Two way com pós -teste de Bonferroni. Valor de significância estatística determinada no gráfico (p < 0,05). 77 Figura 6 – Proporção de detecção de micoplasmas e outros microrganismos de interesse genital entre as mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle) em amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia obtidas de mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Caso Controle 0 50 100 Negativo MH UU UP MG + MH MG + UU MG + UP MH + UU MH + UP MG + MH + UU MG + MH + UP MG + MH + UU + UP P < 0,001 A HPV HPV + MH HPV + UP HPV + MG + MH + UU NG Porcentagem de mulheres Caso Controle 0 50 100 Negativo MH MG MG + MH MG + MH + UU P = 0,0002 B HPV + MG HPV + MH HPV + MG + MH Porcentagem de mulheres Caso Controle 0 50 100 Negativo MH MG MG + MH P < 0,0001 C HPV HPV + MG Porcentagem de mulheres Legenda: MG: M. genitalium ; MH: M. hominis ; UU: U. urealyticum; UP: U. parvum ; HPV: Papilomavírus Humano; NG: N. gonorrhoeae. (A) Amostras de swab endocervical; (B) Amostras de fluido peritoneal; (C) Amostras de tecido de biópsia. Comparação de proporções por ANOVA – Two way com pós-teste de Bonferroni. Valor de significância estatística determinada no gráfico (p < 0,05). 78 5.6 Perfil de carga microbiana dos Mollicutes nas amostras A carga microbiana foi calculada nos ensaios de qPCR, tomando como base a curva padrão de cada experimento; permitindo assim, a quantificação relativa. No presente estudo, só foi possível comparar as cargas microbianas dos Mollicutes em não de HPV e N. go norrhoeae por conta do tipo de experimento adotado (PCR para HPV) e pela prevalência baixa ou nula nas amostras clínicas – apenas duas amostras foram positivas para N. gonorrhoeae nas amostras de swab endocervical – o que inviabiliza a análise estatística dos dados. Para avaliar se a carga microbiana encontrada nas amostras clínicas diferia entre os grupos caso e controle, foi feita a quantificação por meio da qPCR. Os grupos caso e controle foram comparados apenas quando a detecção do microrganismo ocorre u em ambos os grupos de forma que permitisse a análise estatística. A Figura 7 mostra o número de cópias de DNA de cada microrganismo nos grupos c aso e controle nas amostras de swab. Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os grupos caso (EDT) e controle para as espécies M. genitalium (EDT 48 ± 34 cópias/mL; Controle 90 ± 87 cópias/mL; p = 0,551), M. hominis (EDT 2,6 x 10 4 ± 1,4 x 10 6 cópias/mL; Controle 2,5 x 10 4 ± 7,1 x 104 cópias/mL; p = 0,931), U. urealyticum (EDT 4,7 x 104 ± 9,2 x 10 4 cópias/mL; Controle 1,0 x 10 4 ± 0 cópias/mL; p = 0,857) e U. parvum (EDT 2,9 x 10 4 ± 3,1 x 10 4 cópias/mL; Controle 6,7 x 10 4 ± 4,4 x 10 4 cópias/mL; p = 0,147). A mesma análise foi feita para as cargas microbianas com os dados de detecção nas amostras de fluido peritoneal (Figura 8). Como é possível observar, não houve diferença estatisticamente signific ante entre os grupos caso (EDT) e controle para as espécies M. genitalium (EDT 100 ± 293 cópias/mL; Controle 37 ± 25 cópias/mL; p > 0,05), M. hominis (EDT 1,4 x 103 ± 795 cópias/mL; Controle 1,1 x 10 3 ± 961 cópias/mL; p > 0,05) (Figura 8). Nas amostras de tecido de biópsia, não houve diferença estatística na carga microbiana de M. genitalium (EDT 77 ± 30 cópias/mL; Controle 81 ± 50 cópias/mL; p > 0,05) quando comparados os grupos (Figura 9). 79 Figura 7 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de micoplasmas (Cópias/mL) em amostras de swab endocervical mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Caso (EDT) Controle 101 102 103 104 105 106 107A qPCR M. genitalium Cópias/mL Caso (EDT) Controle 101 102 103 104 105 106 107B qPCR M. hominis Cópias/mL Caso (EDT) Controle 101 102 103 104 105 106 107C qPCR U. parvum Cópias/mL Caso (EDT) Controle 101 102 103 104 105 106 107D qPCR U. urealyticum Cópias/mL Legenda: (A) Número de cópias de M. genitalium nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 10; Controle: n = 3) (B) Número de cópias de M. hominis nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 31; Controle: n = 11); (C) Número de cópias de U. parvum nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 10; Controle n = 6); (D) Número de cópias de U. urealyticum nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 6; Controle n = 1) ;. Desvio padrão e medianas estão indicados por linhas sólidas nos gráficos. Análise estatística realizada por Mann Whitney. p < 0,05. 80 Figura 8 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Caso (EDT) Controle 100 101 102 103 104 105 106 107A qPCR M. genitalium Cópias/mL Caso (EDT) Controle 100 101 102 103 104 105 106 107B qPCR M. hominis Cópias/mL Legenda: (A) Número de cópias de M. genitalium nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 22 ; Controle: n = 05 ); (B) Número de cópias de M. hominis nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 15; Controle: n = 04). Desvio padrão e mediana estão indicados por linhas sólidas nos gráficos. Análise estatística realizada por Mann Whitney. p < 0,05. Figura 9 – Quantificação absoluta por qPCR do número de cópias de espécies de micoplasmas em amostras de tecido de biópsia em mulheres com e sem endometriose, São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Caso (EDT) Controle 101 102 103 104 105 106 107A qPCR M. genitalium Cópias/mL Legenda: (A) Número de cópias de M. genitalium nas amostras dos grupos caso e controle (Caso EDT: n = 09; Controle: n = 02). Desvio padrão e mediana estão indicados por linhas sólidas nos gráficos. Análise estatística realizada por Mann Whitney. p < 0,05. 81 5.7 Detecção microbiana de acordo com o perfil clínico Após definir o perfil clínico da população est udada e realizar a detecção dos microrganismos nas amostras clínicas, foi avaliada a possível associação entre a detecção dos microrganismos e os sintomas referidos pelas mulheres. Neste contexto, a detecção de U. parvum nas amostras de swab endocervical foi relacionada à maior severidade do sintoma dispareunia (EAD ≥ 7; p = 0,019) (Tabela 6). Não houve associação dos demais microrganismos ( M. genitalium, M. hominis , U. urealyticum e U. parvum ) detectados nas amostras de swab endocervical com a maior severidade dos sintomas (p > 0,05). De maneira similar, não foi observada associação estatisticamente significante (p > 0,05) entre os microrganismos (Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae ) e os sintomas quando observada a prevalência destes nas amostr as de fluido peritoneal e de tecido de biópsia. Também não houve associação estatisticamente significante com a variável infertilidade (p > 0,05) (Apêndices J, K e L). 82 Tabela 6 – Detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP. Nota: Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 15 (n = 89); 2Dos pélvica cíclica: perda de 15 (n = 89); 3Dispareunia: perda de 16 (n = 88); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 14 (n = 90); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 14 (n = 90); 6Infertilidade: perda de 17 (n = 87) * Teste de Qui-quadrado: significância estatística quando p < 0,05 EAD: Escala Analógica de Dor. Sintomas Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de swab endocervical M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* Dismenorreia (EAD), n (%)1 ≥ 7 < 7 9 (69,2) 53 (69,7) 0,97 [0,23; 3,49] 1,000 30 (78,9) 32 (62,7) 2,22 [0,84; 5,84] 0,100 6 (85,7) 56 (68,3) 2,78 [0,31; 24,33] 0,593 11 (78,6) 51 (68,0) 1,72 [0,44; 6,76] 0,636 4 (30,8) 23 (30,3) 8 (21,1) 19 (37,3) 1 (14,3) 26 (31,7) 3 (21,4) 24 (32,0) Dor pélvica cíclica (EAD), n (%)2 ≥ 7 < 7 5 (38,5) 30 (39,5) 0,94 [0,28; 3,20] 0,945 16 (42,1) 19 (37,3) 1,22 [0,51; 2,89] 0,643 2 (28,6) 33 (40,2) 0,59 [0,10; 3,24] 0,839 6 (42,9) 29 (38,7) 1,19 [0,37; 3,78] 0,768 8 (61,5) 46 (60,5) 22 (57,9) 32 (62,7) 5 (71,4) 49 (59,8) 8 (57,1) 46 (61,3) Dispareunia (EAD), n (%)3 ≥ 7 < 7 4 (30,8) 31 (41,3) 0,63 [0,17; 2,23] 0,681 16 (42,1) 19 (38,0) 1,18 [0,50; 2,80] 0,697 2 (28,6) 33 (40,7) 0,58 [0,10; 3,18] 0,819 10 (71,4) 25 (33,8) 4,90 [1,39; 17,19] 0,019 9 (69,2) 44 (58,7) 22 (57,9) 31 (62,0) 5 (71,4) 48 (59,3) 4 (28,6) 49 (66,2) Alt. intest. cíclicas (EAD), n (%)4 ≥ 7 < 7 2 (15,4) 17 (22,1) 0,64 [0,13; 3,17] 0,857 10 (26,3) 9 (17,3) 1,70 [0,61; 4,72] 0,301 2 (28,6) 17 (20,5) 1,55 [0,22; 8,71] 0,983 2 (13,3) 17 (22,7) 0,52 [0,10; 2,55] 0,644 11 (84,6) 60 (77,9) 28 (73,7) 43 (82,7) 5 (71,4) 66 (79,5) 13 (86,7) 58 (77,3) Alt. urin. cíclicas (EAD), n (%)5 ≥ 7 < 7 1 (7,7) 11 (14,3) 0,50 [0,05; 4,23] 0,837 4 (10,5) 8 (15,4) 0,64 [0,18; 2,32] 0,722 1 (14,3) 11 (13,3) 1,09 [0,12; 9,94] 1,000 2 (13,3) 10 (13,3) 1,00 [0,19; 5,10] 1,000 12 (92,3) 66 (85,7) 34 (89,5) 44 (84,6) 6 (85,7) 72 (86,7) 13 (86,7) 65 (86,7) Infertilidade, n (%)6 Sim Não 5 (38,5) 31 (41,9) 0,86 [0,25; 2,90] 0,817 15 (40,5) 21 (42,0) 0,94 [0,39; 2,23] 0,891 3 (50,0) 33 (40,7) 1,45 [0,27; 7,65] 0,657 7 (43,8) 29 (40,8) 1,12 [0,37; 3,36] 0,831 8 (61,5) 43 (58,1) 22 (59,5) 29 (58,0) 3 (50,0) 48 (59,3) 9 (56,2) 42 (59,2) 82 83 Foi avaliada a relação entre a detecção de microrganismos nas amostras clínicas com o estadiamento da endometriose (I – IV) e o sítio mais grave acometido pela doença (peritoneal, ovariana ou profunda). Não houve associação estatisticamente significante co m as espécies de Mollicutes. (Apêndice M, N e O) ou com os demais microrganismos (HPV e N. gonorrhoeae) (Tabela 7). Contudo, é válido destacar que ao ser avaliada a relação entre a presença de M. hominis em amostras de fluido peritoneal e o perfil de estadiamento da endometriose, a significância estatística foi limítrofe (OR 3,55, 95% IC 0,96 – 13,16 p = 0,050), como pode ser observado no apêndice N. Além disso, é válido destacar que a detecção de HPV ocorreu de forma marcante dentre as mulheres com endomet riose profunda, nas três amostras analisadas (Tabela 7). 84 Tabela 7 – Perfil de Detecção de HPV por amostra clínica e de N. gonorrhoeae no swab endocervical, por meio da qPCR, e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose. Nota: Perda de observação: 1ASRM estádio: Swab HPV – perda de 36 (n = 68); Fluido HPV – perda de 52 (n = 52); Tecido de biópsia – perda de 37 (n = 67); Swab N. gonorrhoeae – perda de 33 (n = 71). Nota: Perda de observação: 2Tipo de Endometriose: Swab HPV - perda de 10 (n = 94); Fluido peritoneal HPV – perda de 29 (n = 75); Tecido de Biópsia HPV – Perda de 07 (n = 97); Swab N. gonorrhoeae – perda de 4 (n = 100). *Significância estatística quando p < 0,05 ¥ Razão de Verossimilhança Variáveis Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo por amostra HPV Swab N. gonorrhoeae Swab endocervical Fluido peritoneal Tecido de biópsia qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* ASRM estádio, n (%)1 I e II III e IV 1 (25)) 34 (53,1) 0,29 [0,02;2,98] 0,349ɸ 2 (40,0) 26 (55,3) 0,53 [0,08; 3,52] 0,652ɸ 0 (0) 34 (52,3) ND - - 0 (0) 37 (52,1) ND -- -- 3 (75) 30 (46,9) 3 (60,0) 21 (44,7) 2 (100) 31 (47,7) 0 (0) 34 (47,9) Tipo de Endom, n (%)2 Sem Endometriose Peritoneal Ovariana Profunda 1 (20,0) 26 (29,2) 1,00 0,917¥ 0 (0) 23 (32,9) 1,00 -- -- 1 (33,3) 29 (30,9) 1,00 1,000¥ 2 (100) 28 (28,6) 1,00 -- 0 (0) 15 (16,9) ND -- 2 (40,0) 8 (11,4) ND -- 0 (0) 13 (13,8) ND -- 0 (0) 15 (15,3) ND -- 0 (0) 2 (2,2) ND -- 0 (0) 2 (2,9) ND -- 0 (0) 2 (2,1) ND -- 0 (0) 2 (2,0) ND -- 4 (80,0) 46 (51,7) 0,44 [0,04; 4,16] 3 (60,0) 37 952,9) ND -- 2 (66,7) 50 (53,2) 0,86 [0,75; 9,92] 0 (0) 53 (54,1) ND -- 84 85 Ao ser avaliada a relação entre a detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae, nas amostras clínicas de swab endocervical e o quadro clínico das pacientes, não foi observada associação estatisticamente significante (Tabela 8, 9 e 10). Tabela 8 – Detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae em amostras de swab por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas. Resultado qPCR Amostras de swab endocervical Grupo Total (N = 104) Odds Ratio IC 95% p* Endometriose (n = 73) Controle (n = 31) M. genitalium, n (%)1 Positivo Negativo 10 (14,1) 3 (11,1) 13 (13,3) 1,31 [0,33; 5,18] 0,698 61 (85,9) 24 (88,9) 85 (86,7) M. hominis, n (%)1 Positivo Negativo 31 (43,7) 11 (40,7) 42 (42,9) 1,12 [0,45; 2,77] 0,794 40 (56,3) 16 (59,3) 56 (57,1) U. urealyticum, n (%)1 Positivo Negativo 6 (8,5) 1 (3,7) 7 (7,1) 2,4 [0,27; 20,92] 0,415 65 (91,5) 26 (96,3) 91 (92,9) U. parvum, n (%)1 Positivo Negativo 10 (14,1) 6 (22,2) 16 (16,3) 0,57 [0,18; 1,77] 0,330 61 (85,9) 21 (77,8) 82 (83,7) Micoplasma, n (%)1 Sim Não 39 (54,9) 16 (59,3) 55 (56,1) 0,83 [0,34; 2,05] 0,700 32 (45,1) 11 (40,7) 43 (43,9) HPV, n (%)2 Positivo Negativo 4 (5,9) 1 (3,7) 5 (5,3) 1,62 [0,17; 15,23] 1,000ɸ 64 (94,1) 26 (96,3) 90 (94,7) N. gonorrhoeae, n (%)3 Positivo Negativo 0 (0) 2 (6,7) 2 (2,0) 3,53 [2,58; 4,83] 0,086ɸ 71 (100,0) 28 (93,3) 99 (98,0) Nota: Perda de observação: 1M. genitalium; M. hominis; U. urealyticum e U. parvum: perda de 6 (n = 98); 2HPV: perda de 9 (n = 95); 3N. gonorrhoeae: perda de 3 (n = 101). *Teste de Qui-quadrado, significante quando p < 0,05 ɸTeste Exato de Fisher 86 Tabela 9 – Detecção de Mollicutes, HPV e N. gonorrhoeae em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas. Nota: Perda de observação: 1qPCR para Mollicutes: perda de 26 (n = 78); 2Infecção por micoplasmas: perda de 26 (n = 78); 3qPCR HPV: perda de 29 (n = 75); 4qPCR N. gonorrhoeae: perda de 26 (n = 78). ND: Não definida *p valor estatisticamente significante se < 0,05. †Teste de Qui-quadrado Resultado qPCR Amostras de Fluido Peritoneal Grupo Total (N = 78) Odds Ratio IC 95% p* Endometriose (n = 54) Controle (n = 24) M. genitalium, n (%)1 Positivo Negativo 22 (40,7) 5 (20,8) 27 (34,6) 2,61 [0,84; 8,04] 0,088† 32 (59,3) 19 (79,2) 51 (65,4) M. hominis, n (%)1 Positivo Negativo 15 (27,8) 4 (16,7) 19 (24,4) 1,92 [0,56; 6,56] 0,442† 39 (72,2) 20 (83,3) 59 (75,6) U. urealyticum, n (%)1 Positivo Negativo 2 (3,7%) 0 (0) 2 (2,6) ND -- -- 52 (96,3) 24 (100) 76 (97,4) U. parvum, n (%)1 Positivo Negativo 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND -- -- 54 (100) 24 (100) 78 (100) Micoplasma no Fluido, n (%)2 Sim Não 29 (53,7) 8 (33,3) 37 (47,4) 2,32 [0,85; 6,32] 0,096† 25 (46,3) 16 (66,7) 41 (52,6) HPV, n (%)3 Positivo Negativo 5 (9,6) 0 (0) 5 (6,7) ND -- -- 47 (90,4) 23 (100) 70 (93,3) N. gonorrhoeae, n (%)4 Positivo Negativo 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND -- -- 54 (100) 24 (100) 78 (100) 87 Tabela 10 – Detecção de Mollicutes , HPV e N. gonorrhoeae em amostras de tecido por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico das pacientes incluídas. Nota: Perda de observação: 1qPCR para microrganismos: perda de 6 (n = 98); 2qPCR para HPV: perda de 7 (n = 97); 3qPCR para N. gonorrhoeae: perda de 6 (n = 98). ND: Não definida *p valor estatisticamente significante se < 0,05. †Teste de Qui-quadrado ɸTeste de Fisher Resultado qPCR Amostras de Tecido Grupo Total (N = 98) Odds Ratio IC 95% p* Endometriose (n = 68) Controle (n = 30) M. genitalium, n (%)1 Positivo Negativo 9 (13,2) 2 (6,7) 11 (11,2) 2,13 [0,43; 10,54] 0,547† 59 (86,8) 28 (93,3) 87 (88,8) M. hominis, n (%)1 Positivo Negativo 4 (64,0) 0 (0) 4 (4,1) ND -- -- 64 (94,1) 30 (100) 94 (95,9) U. urealyticum, n (%)1 Positivo Negativo 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND -- -- 68 (100) 30 (100) 98 (100) U. parvum, n (%)1 Positivo Negativo 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND -- -- 68 (100) 30 (100) 98 (100) Micoplasma no Tec., n (%)1 Sim Não 36 (52,9) 16 (53,3) 52 (53,1) 1,03 [0,41; 2,32] 0,971† 32 (47,1) 14 (46,7) 46 (46,9) HPV, n (%)2 Positivo Negativo 2 (3,0) 1 (3,3) 3 (3,1) 0,89 [0,07; 10,23] 1,000ɸ 65 (97,0) 29 (96,7) 94 (96,9) N. gonorrhoeae, n (%)3 Positivo Negativo 0 (0) 0 (0) 0 (0) ND -- -- 68 (100) 30 (100) 98 (100) 88 5.8 Padrões de resposta imune na população estudada A Figura 10 indica a relação entre a condição clínica de cada grupo de pacientes e a concentração das citocinas na amostra de fluido peritoneal. É possível observar que IFN -γ teve produção aumentada no grupo de mulheres caso infectadas por M. genitalium (EDT + MG) quando comparadas com os grupos controle (CN) (p = 0,049) e caso (EDT) (p = 0,012), ambos sem infecção (Figura 6A). Perfil similar ocorreu para a produção de IL-1β (Figura 10B). Outra citocina pró-inflamatória a qual também apresentou níveis elevados nos grupos caso (EDT e EDT+ MG) em comparação ao grupo controle (CN) foi IL-6 (Figura 10F). A diferença entre os grupos foi estatisticamente significante e indicam maior produção da citocina relacionada à doença e, em concentração menor, quando associada à infecção por M. genitalium. É válido ressaltar que, assim como mostrado no apêndice G, 63% das pacientes caso e positivas para M. genitalium tinham endometriose profunda. As citocinas IL-12, IL-13, IL-18, TNF- α e IL -10 não apresentaram concentrações com diferença estatisticamente significante entre os grupos. Outras citocinas avaliadas no fluido peritoneal, neste mesmo ensaio, apresentaram valores de dosage ns abaixo do limite de detecção da curva padrão de referência e não estão representadas. 89 Figura 10 – Quantificação de citocinas em amostras de fluido peritoneal de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso). CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 200 400 600 800 1000 p = 0,0127 p = 0,049 A IFN- (pg/mL) CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 10 20 30 40 50 50 100 150 200 p = 0,0291 p = 0,0176 B IL-1  pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 5 10 15 20 C IL-12 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 10 20 30 40 D IL-13 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 500 1000 1500 EIL-18 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 200 400 600 800 1000 2000 4000 6000 8000 p < 0,001 p = 0,0467 F IL-6 (pg/mL) CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH EDT + UU 0 50 100 150 G TNF- (pg/mL) CN CN + MGCN + MH EDT EDT + MGEDT + MHEDT + UU 0 50 100 150 200 H IL-10 (pg/ml) Legenda: CN: Mulheres controle sem infecção por micoplasmas; CN + MG: Mulheres controle positivas para M. genitalium ; CN + MH: Mulheres controle positivas para M. hominis ; EDT: Mulheres caso sem infecção por micoplasmas; EDT + MG : Mulheres caso positivas para M. genitalium; EDT + MH: Mulheres caso positivas para M. hominis ; EDT + UU: Mulheres caso positivas para U. urealyticum. (A) INF -γ; (B) IL -1β; (C) IL -12; (D) IL -13; (E) IL -18; (F) IL -6; (G) TNF-α; (H) IL-10. Dados expressos pela Média ± Desvio Padrão. p < 0,05. 90 As Figuras 11 e 12 apresentam as dosagens das citocinas nos tecidos de biópsia obtidos de mulheres com e sem endometriose, infectadas ou não por Mollicutes. O grupo controle infectado com M. genitalium (CN + MG) apresentou níveis mais elevados de produção de IFN-γ quando comparado ao grupo controle não infectado (CN; p = 0,005) e ao grupo caso também infectado com M. genitalium (EDT + M. genitalium; p =0,022) (Figura 11A). As citocinas IL-18 e IL- 13 apresentaram níveis mais altos no grupo controle infectado com M. genitalium (CN + MG) quando comparado ao grupo controle não infectado (CN; p < 0,05) (Figura 11B e 11E). Nas figuras 12B e 12E, de forma similar, TNF -α e IL -23 apresentaram níveis mais elevados no grupo controle infectado com M. genitalium (CN + MG) quando comparado ao grupo controle não infectado (CN; p 0,05). 91 Figura 11 – Quantificação de citocinas em amostras de tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso). CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0100200300400500 2000 4000 6000 8000 10000 10000 15000 20000 25000 p = 0,0059 p = 0,0225 A IFN- (pg/mL) CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 2000 4000 6000 8000 p = 0,0017 B IL-18 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 200 250 C IL-1  pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 D IL-12 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 p = 0,0094 E IL-13 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 200 250 F IL-5 (pg/ml) Legenda: CN: Mulheres controle sem infecção por micoplasm as; CN + MG: Mulheres controle positivas para M. genitalium ; CN + MH: Mulheres controle positivas para M. hominis ; EDT: Mulheres caso sem infecção por micoplasmas; EDT + MG: Mulheres caso positivas para M. genitalium; EDT + MH: Mulheres caso positivas para M. hominis; (A) INF-γ; (B) IL-18; (C) IL-1β; (D) IL-12; (E) IL-13; (F) IL-6. Dados expressos pela Média ± Desvio Padrão. 92 Figura 12 – Quantificação de citocinas em amostras de tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle) e mulheres com endometriose (grupo caso). CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 100 200 300 1000 2000 3000 A IL-6 (pg/mL) CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 100 200 300 p = 0,0498 B TNF- (pg/mL) CN CN + MG EDT EDT + MG EDT + MH 0 10 20 30 40 C IL-17 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 200 250 D IL-21 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 100 200 300 400 500 p = 0,0160 E IL-23 pg/mL CN CN + MG CN + MH EDT EDT + MG EDT + MH 0 50 100 150 200 250 F IL-9 (pg/ml) Legenda: CN: Mulheres controle sem infecção por micoplasmas; CN + MG: Mulheres controle positivas para M. genitalium ; CN + MH: Mulheres controle positivas para M. hominis ; EDT: Mulheres caso sem infec ção por micoplasmas; EDT + MG: Mulheres caso positivas para M. genitalium; EDT + MH: Mulheres caso positivas para M. hominis; (A) IL-6; (B) TNF- -17; (D) IL-21; (E) IL-23; (F) IL-9. Dados expressos pela Média ± Desvio Padrão. 93 5.9 Perfil da expressão gênica na população estudada As figuras de 13 a 17 mostram a análise de expressão de genes ligados às vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida em amostras de tecido de biópsia e fluido peritoneal . A Figura 13 mostra que, dos 84 genes analisados, 11 estavam em upregulation (verde) e dois estavam em downregulation (vermelha), quando comparados os tecidos de biópsia de lesão de endometriose (grupo caso) e o tecido de biópsia de peritônio sadio (grupo controle). Houve diferença estatística entre os dois grupos para todos os genes que estavam em upregulation (TLR8, TLR2, TLR1, IL1R1, IL1B, IFNG, IFNB1, CRP, CD86, CASP1 e APCS). Dos genes em downregulation, apenas IFNAR1 apresentou diferença estatisticame nte significante entre os dois grupos (p < 0,05). Não foi observado diferença de expressão gênica entre mulheres com endometriose com ou sem M. genitalium. Figura 13 – Análise de expressão gênica no tecido de biópsia de mulheres com endometriose (grupo ca so) comparado com tecido de biópsia de mulheres sem endometriose (grupo controle). -3 -2 -1 0 1 2 APCS CASP1 CD86 CRP FOXP3 IFNAR1 IFNB1 IFNG IL1B IL1R1 TLR1 TLR2 TLR8 * * * * * * * * * * * * Regulation Legenda: Upregulation (verde) e downregulation (vermelho) de genes ligados às vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida. Significância estatística (p<0,05) é representada por asterisco (*) (teste não paramétrico Mann -Whitney - One-tailed test, GraphPad Prism® version 6.01). 94 A Figura 14, por sua vez, mostra a análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose (grupo caso) e sem endometriose (grupo controle). Na figura observa -se que, nas células, o perfil de downregulation ocorreu par a a maior parte dos genes; 28 no total. Destes, cinco apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos (SLC11A1, NLRP3, NFKBIA, ITGAM e CD80). Os dois genes que em upregulation não apresentaram diferença estatisticamente significante en tre os grupos (p > 0,05). 95 Figura 14 – Análise de expressão gênica nas células do fluido peritoneal de mulheres com endometriose (grupo caso) comparado fluido peritoneal de mulheres sem endometriose (grupo controle). -10 -5 0 5 C3 CCR8 CD14 CD40 CD80 CXCR3 GATA3 IFNAR1 IL10 IL17A IL1A IL1R1 IL23A CXCL8 ITGAM LYZ MBL2 MPO NFKBIA NLRP3 SLC11A1 STAT6 TBX21 TICAM1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR9 TRAF6 * * * * * Regulation Legenda: Upregulation (verde) e downregulation (vermelho) de genes ligados as vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida. Significância estatística (p<0.05) é representada por asterisco (*) (teste não paramétrico Mann -Whitney - One-tailed test, GraphPad Prism® version 6.01). 96 Na figura 15, é possível observar o perfil de expressão gênica das células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e infectadas por M. genitalium, em comparação com mulheres também com endometriose e sem infecção por nenhum dos Mollicutes pesquisados nas amostras. Observou-se a acentuação do perfil em downregulation de uma quantidade ainda maior de genes (n = 46). Ao todo, oito genes em downregulation apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos ( TYK2, TBX21, STAT1, MX1, IL5, HLA-A, CD86 e CD14). 97 Figura 15 – Análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para M. genitalium comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas. -15 -10 -5 0 5 APCS C3 CASP1 CCR4 CCR5 CCR6 CCR8 CD14 CD4 CD40 CD40LG CD86 CXCR3 DDX58 FASLG HLA-A HLA-E ICAM1 IFNA1 IFNB1 IFNG IFNGR1 IL1B IL1R1 IL2 IL23A IL4 IL5 IL6 IRAK1 MAPK8 MPO MX1 NFKB1 NOD1 RAG1 RORC STAT1 STAT3 TBX21 TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR8 TNF TYK2 * * * * * * * * Regulation Legenda: Upregulation (verde) e down-regulation (vermelho) de genes ligados as vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida. Significância estatística (p<0.05) é representada por asterisco (*) (teste não paramétrico Mann-Whitney - One-tailed test, GraphPad Prism® version 6.01). 98 A Figura 16, mostra o perfil de expressão gênica das células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose. Contudo, compara -se o grupo de mulheres infectadas por M. hominis e de mulheres também com endometriose e sem infecção por nenhum dos Mollicutes pesquisados nas amostras. Observou-se que na presença de M. hominis o perfil de expressão muda para a acentuação da upregulation de diversos genes (n = 42). Destes, quatro genes em upregulation (STAT6, MAPK1, IRF3 e GATA3) apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos (p< 0,05). Apenas dois genes estavam em downregulation, um deles (CD4) apresentou diferença estatisticamente significante entre os grupos (p< 0,05). 99 Figura 16 – Análise de expr essão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para M. hominis comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas. -10 0 10 20 APCS CCR6 CCR8 CD4 CD40 CD80 CRP CSF2 CXCL10 DDX58 FOXP3 GATA3 IFNA1 IFNAR1 IL10 IL13 IL17A IL18 IL1A IL2 IL23A IL4 CXCL8 IRF3 LY96 LYZ MAPK1 MBL2 MPO MX1 MYD88 NFKBIA NLRP3 NOD1 NOD2 RORC SLC11A1 STAT6 TLR1 TLR5 TLR6 TLR7 TLR9 TRAF6 * * * * * Regulation Legenda: Upregulation (verde) e down-regulation (vermelho) de genes ligados as vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida. Significância estatística (p< 0.05) é representada por asterisco (*) (teste não paramétrico Mann-Whitney - One-tailed test, GraphPad Prism® version 6.01). 100 A Figura 17, mostra o perfil de expressão gênica das células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose e infecta das por qualquer micoplasma em comparação com mulheres também com endometriose e sem infecção por nenhum dos micoplasmas. Observa -se que o perfil de downregulation prevalece para a maioria dos genes analisados (n = 30). Apenas um gene apresentou upregulation. Dentre os genes em downregulation, sete genes ( TBX21, MAPK8, IRAK1, IFNGR1, HLA-A e CDA4) apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos (p< 0,05). 101 Figura 17 – Análise de expressão gênica de células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose positivas para qualquer micoplasma comparado com células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção por micoplasmas. -8 -6 -4 -2 0 2 4 APCS C3 CCR4 CCR5 CD14 CD4 CD40LG CXCR3 HLA-A HLA-E IFNA1 IFNB1 IFNG IFNGR1 IL1B IL1R1 IL2 IL4 IL5 IL6 IRAK1 LYZ MAPK8 RAG1 SLC11A1 TBX21 TLR2 TLR3 TLR4 TLR8 TYK2 * * * * * * * Regulation Legenda: Upregulation (verde) e downregulation (vermelho) de genes ligados as vias de ativação das respostas imunológicas inata e adquirida. Significância estatística (p<0.05) é representada por asterisco (*) (teste não paramétrico Mann -Whitney - One-tailed test, GraphPad Prism® version 6.01). 102 6 DISCUSSÃO Descrita há mais de 300 anos, a endometriose ainda é uma doença subdiagnosticada. Nas últimas décadas, testemunhou -se evolução na compreensão de diferentes aspectos associados à doença. Contudo, compreender a patogênese e patofisiologia da doença é ainda essencial para melhor diagnóstico e tratamento (BURNEY; GIUDICE, 2012). O diagnóstico da doença pode demorar de 3,8 a 7 anos para ser feito. Isto provoca significativo impacto na qualidade de vida da mulher pela característica debilitante (HUSBY; HAUGEN; MOEN, 2003; SANTOS et al., 2012). O diagnóstico tardio ocorre pela inespecificidade do quadro clínico e a necessidade do diagnóstico cirúrgico (BELLELIS et al., 2011; BURNEY; GIUDICE, 2012). Diferentes fatores de risco foram associados à endometriose como; idade, raça, altura, peso, status socioeconômico, outros (ACIEN; VELASCO, 2013; MISSMER et al., 2004) . Dentre os fatores mencionados neste estudo, não observamos associações estatisticamente significantes (p > 0,05) com a doença, exceto com o gra u de instrução das mulheres (p = 0,015). Não sabemos ainda porque mulheres com maior grau de instrução estão associadas à prevalência da doença. Pesquisadores sugerem associação com o nível socioeconômico mais elevado que facilita ria o acesso à assistência médica de forma precoce (HEMMINGS et al., 2004; MOINI et al., 2013) . C onsideramos que o estilo de vida da mulher na atualidade, com altos níveis de estresse, por conta da busca por sucesso profissional, tendência de ter menos filhos e adiamento da gravidez contribuam para o perfil observado. Pacientes com endometriose apresentam como queixas frequentes sintomas como: dismenorreia, dor pélvica crônica, dispareunia de profundidade, alterações intestinais e urinárias cíclica s como dor ou sangramento ao evacuar/urinar, durante o período menstrual, além de referirem infertilidade (BELLELIS; PODGAEC; ABRÃO, 2014; RIAZI et al., 2015) . Portanto, os resultados obtidos no presente estudo estão de acordo com a literatura pela associação da doença com os sintomas dismenorreia e dispareunia na população estudada (EAD ≥ 7). Em conformidade com a literatura, a infertilidade foi outro fator associado à endometriose neste estudo. É válido ressaltar que, ao analisarmos apenas a presença ou ausência de cada sintoma, os sintomas dor 103 pélvica acíclica e alterações intestinais cíclicas também foram estatisticamente associados ao grupo caso (p < 0,05) (Dado não mostrado). Apesar deste perfil clínico descrito na literatura, a prevalência destes sintomas pode variar consideravelmente nas pacientes (de 30% a 80%) (HEMMINGS et al., 2004; PERRY, 2005) . O diagnóstico da endometriose ainda é um assunto de preocupação e recomenda-se a abordagem mais criteriosa e compreensiva dos achados clínicos de cada paciente para diagnóstico e manejo precoce (RIAZI et al., 2015). No presente estudo, o uso de terapia hormonal pelas pacientes foi associado à endometriose. Acreditamos que isto tenha ocorrido pois esta é uma das alternativas da rotina clínica para tratamento de pacientes com endometriose que apresentam os sintomas de forma acentuada (MELIS et al., 2016). Assim, é compreensível que muitas solicitassem o tratamen to para que melhorassem os sintomas e, consequentemente, sua qualidade de vida até a cirurgia. Neste contexto, dentre os diferentes medicamentos disponíveis, são amplamente utilizados os agonistas de GnRH (GnRHa) (MELIS et al., 2016) . Estes medicamentos atuam provocando um estado hipoestrogênico no organismo das pacientes com diminuição da doença e melhora dos sintomas (BULLETTI et al., 2010). Em contrapartida, mulheres tratadas c om GnRHa com e sem endometriose podem estar mais expostas à colonização bacteriana intrauterina. Isto ocorreria justamente em decorrência do estado hipoes trogênico provocado pelo tratamento. Esteroides, especialmente o estrogênio, são responsáveis por regular o número de peptídeos antimicrobianos (com o defensinas e inibidor de protease secretada por leucócitos) no trato genitourinário e tubas uterinas (KHAN et al., 2016). Após o início da vida sexual, diversos microrganismos podem ser encontrados no trato urogenital das mulheres. Micoplasmas por sua vez podem ser isolados do trato genital inferior de indivíduos saudáveis e mais comumente de indivíduos com distúrbios de etiologia infecciosa (WAITES et al., 2005) . As espécies M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum têm sido mais associadas a diferentes distúrbios , como doença inflamatória pélvica (DIP), infertilidade e uretrite não gonocócica (UNG) (TAYLOR-ROBINSON et al., 2012). Tendo em vista que apenas infecções por HIV e Treponema pallidum, agente etiológico da sífilis, são de notificação obrigatória no Sistema de Agravos de 104 Notificação (SINAN) no Brasil, dados epidemiológicos das Infecções Sexualmente Transmissíveis (ISTs), em âmbito nacional, ainda são escassos (BRASIL, 2012). Assim, conforme proposto neste estudo, foi aplicada a metodol ogia da qPCR para detectar microrganismos de importância genital em amostras clínicas, para fornecer mais dados epidemiológicos nacionais das ISTs, além de avaliar as possíveis implicações destes agentes na etiopatogênese da endometriose. Apesar do ainda alto custo para os serviços de saúde (NASCIMENTO, et al., 2010), a qPCR foi o método escolhido para este estudo devido a sua maior sensibilidade na detecção de microrganismos fastidiosos, como micoplasmas, quando comparado à cultura (AMIRMOZAFARI et al., 2009; SONAWANE; TRIPATHI, 2013). Dentre os Mollicutes estudados, M. genitalium é descrito atualmente como uma IST emergente (MUNOZ; GOJE, 2016; SONNENBERG et al., 2015) . Esta espécie é um dos a gentes etiológicos da UNG em homens, e de in flamação cervical, de síndromes do trato genital superior, como a doença inflamatória pélvica (DIP) e infertilidade em mulhere s (MOBLEY et al., 2012) . Contudo, abordagens ou controvérsias da literatura dificultam a compreensão da participação de M. genitalium na infecção e seu impacto na saúde humana. Assim, seu papel na DIP, infertilidade e gravidez ainda não é conhecido e, portanto, ainda faltam estudos nesta área (MUNOZ; GOJE, 2016). No presente estudo, foi observada a prevalência de 13% de M. genitalium nas amostras de swab endocervical. Os resultados da literatura mencionam que as prevalências deste micoplasma variaram de 0% a 42% (FALK; FREDLUND; JENSEN, 2005; SETHI et al., 2012). No presente estudo, a prevalência foi maior do que em outro estudo realiz ado no sul do Brasil (0,9%) por meio da PCR convencional (ANDERSEN et al., 2007) e menor do que em nosso estudo prévio (32,2%) com uso da qPCR em pacientes do Nordeste do país (CAMPOS et al. , 2015). Como observado, a prevalência deste microrganismo em amos tras de swab endocervical pode variar bastante. As diferenças nos métodos utilizados e o contexto sociocultural no qual cada estudo foi realizado podem justificar as variações. Neste sentido, revisões sistemáticas e a realização de estudos que avaliem as p ossíveis variáveis com viés epidemiológico poderiam justificar melhor esta relação. 105 A participação de M. hominis nas infecções genitais ainda é controverso, pincipalmente por não haver consenso se esta espécie faz parte da microbiota do trato reprodutor feminino (LARSEN; HWANG, 2010) . De fato, estudo realizado por Astrauskiene et al., (2012) reportou prevalência de 3,3% em mulheres lituanas virgens, o que reforça este argumento. Contudo, é preciso salientar que prev alências de 1,3% e 2,6% (MAEDA et al., 2004) , 12,1% (JOMBO; ENENEBEAKU, 2008) e 16,5% (DOH et al., 2004) já foram descritas em mulheres com e sem distúrbios genitais. Em estudo realizado também no sudeste do Brasil, prevalência de 21,9% foi descrita (RODRIGUES et al., 2011). Outro estudo recente realizado com mulheres na cidade de São Paulo, atendidas em clínica de diagnóstico laboratorial não governamental, reportou prevalência de 3,42% (MILANEZI et al., 2016). A alta prevalência descrita no presente estudo (43%), quando analisadas amostras de swab endocervical, pode estar associada ao método diagnóstico empregado quando comparado aos demais estudos, os quais, majoritariamente, utilizaram a PCR convencional ou a cultura como métodos. Nesse contexto, um exem plo é o estudo prévio realizado por nosso grupo de pesquisa que reportou prevalência de 15,9% quando utilizada a PCR convencional e de 31,8% (CAMPOS et al., 2015) quando utilizada a qPCR. Além disso, fatores associados ao contexto geográfico e social de ca da população podem justificar a variação da prevalência. Espécies do gênero Ureaplasma estão envolvidas na patogênese de diversas doenças, como uretrite não -gonocócica e não -clamidial em homens, vaginose bacteriana, corioamnionite e eventos como parto prematuro (PATEL; NYIRJESY, 2010; WAITES et al., 2005) . Prevalência de 7% e 16% foram observadas para U. urealyticum e U. parvum , respectivamente, dentre as pacientes do presente estudo, sendo estes resultados não muito diferente s de outros estudos. Cunningham et al., (2013) descreveram prevalência de 12% para U. urealyticum em amostras do trato geniturinário e, em estudo realizado por BERLE et al. , (2012), na Rússia, descreveram prevalência similar (12,8%) em amostras de urina. Ambos os trabalhos utilizaram a qPCR como método diagnóstico. De forma interessante, a prevalência da infecção pelo gênero Ureaplasma sp. no presente estudo (21%), não foi alta como observada em outros trabalhos que reportaram prevalências de 41% (CUNNINGHAM et al., 2013) e 41,7% (YAMAZAKI et al., 2012) . Por outro lado, como esperado, a 106 prevalência de U. parvum foi maior que a de U. urealyticum como descrito por outros autores (BAO et al., 2010; DE FRANCESCO et al., 2009; GUPTA et al., 2009; HUMBURG et al., 2012). O HPV é consi derado causa necessária para o desenvolvimento do câncer cervical; quarto tipo de câncer mais comum nas mulheres em todo o mundo (IARC, 2012). No presente estudo, 5% das amostras clínicas de swab endocervical foram qPCR-positivas. A prevalência descrita no período de 1989 a 2008 em diferentes estados do Brasil (São Paulo, Pará, Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Ceará e Rio de Janeiro) variou de 13,7% a 54,3% (AYRES; SILVA, 2010). A baixa prevalência, ao compararmos com outros estudos nacionais, pode estar associada ao perfil da população atendida nas clínicas (maior número de mulheres com ensino superior completo), aliado à qualidade do serviço em acompanhar as mulheres por meses até o momento da cirurgia com exames constantes. Neisseria gonorrhoeae, agente etiológico da IST gonorreia ou blenorragia, pode causar cervicite, doença inflamatória pélvica e infertilidade nas mulheres. Comumente infecta a cérvix uterina de forma assintomática (ASHSHI et al., 2015). No presente estudo, foi de tectada apenas em amostras de swab endocervical, com prevalência de 1,9%. Este dado está de acordo com a prevalência encontrada nas américas, dentre as mulheres (2,0%) (WHO, 2014). A maior incidência normalmente ocorre em adultos jovens (15 a 29 anos) e, e m muitos países, em homens que fazem sexo com homens (BIGNELL et al., 2013). Até o momento, não foram encontrados estudos que relacionassem a pesquisa de micoplasmas em amostras de fluido peritoneal e/ou tecido de biópsia da cavidade abdominal com a endo metriose. O s dados apresentados evidenciam de forma interessante a tendência da diminuição da prevalência da maioria dos Mollicutes (M. hominis , U. urealyticum , U. parvum ) quando avaliadas, nesta ordem: amostras de swab endocervical, fluido peritoneal e lesão de endometriose/peritônio sadio. Para M. hominis, as prevalências para as três amostras clínicas foram de 43%, 17,9% e 3,8% respetivamente. Para U. urealyticum foram de 7,0%, 1,9% e 0% respectivamente. Para U. parvum, foram de 16,0%, 0% e 0% respectivamente. Esta tendência observada, em teoria, acompanha a hipótese proposta por Khan et al., (2016) de que o fluxo retrógrado da menstruação carrearia parte dos microrganismos através das trompas de 107 falópio, alcançando os ovários. Acreditamos que, assim como proposto pela teoria de Sampson, ao alcançar tal sítio anatômico este tecido seria extravasado para a cavidade peritoneal. Esta hipótese, também proposta por Khan et al. (2016), explicaria os achados de microrganismos nas amostras de fluido peritoneal e de tecido colhido da cavidade abdominal. A hipótese proposta por estes autores é reforçada pelos achados destes em seus estudos, nos quais evidenciaram a presença de diferentes microrganismos (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida sp, Gardnerella sp. dentre outros) na cavidade uterina (KHAN et al., 2010; KHAN et al., 2014) , além do fluido cístico ovariano em mulheres com endometriose (KHAN et al., 2016) e indícios de colonização da cavidade peritoneal ao reportarem a presença de endotoxinas em fluido peritoneal (KHAN et al., 2010) . As evidências demonstradas por estes autores reforçam a hipótese de que a cavidade uterina e demais sítios anatômicos onde são encontradas lesões de endometriose podem ser colonizados com frequência dada a dinâmica proposta pela teoria de Sampson. É válido ressaltar que os estudos citados (KHAN et al., 2010; KHAN et al., 2014) utilizaram a cultura como método de detecção e, portanto, atestam a viabilidade destes microrganismo s nas amostras clínicas obtidas, diferente do método adotado no presente estudo. Apesar das dificuldades inerentes ao cultivo de microrganismos fastidiosos, como micoplasmas, seria desafiador, porém interessante e recomendável, estudo futuro e mais extenso com uso desta abordagem. Assim, em nosso estudo, apesar da ausência de dados em literatura, propõe-se duas explicações para a diminuição da prevalência destes microrganismos nas amostras clínicas na ordem swab endocervical, fluido peritoneal e tecido de biópsia: (i) durante a migração do tecido por meio da menstruação retrógrada haveria a diminuição da carga microbiana dos microrganismos ao longo do trajeto, (ii) como o fluido peritoneal se apresenta como um ultrafiltrado do plasma sanguíneo extravasado através do peritônio, o acúmulo natural deste em determinadas regiões anatômicas da pelve como o Fundo de Saco de Douglas, favoreceria a amostragem de material proveniente de diferentes regiões anatômicas ao mesmo tempo. Isto justificaria também a prevalência menor encontrada nos tecidos de ambos os grupos por se tratar de amostra restrita a determinada região anatômica e, ainda, ao fato de que nem todas as amostras analisadas foram de lesões superficiais. 108 De forma interessante e intrigante, os achados para M. genitalium foram diferentes dos demais microrganismos e não apresentaram o mesmo padrão observado. As prevalências encontradas nas amostras de swab endocervical, fluido e tecido foram de 13,0%, 25,5% e 10,4% respectivamente. Aspectos associados à epidemiologia e patogenicidade de M. genitalium podem ajudar a explicar estes achados. Grzesko et al. , (2009) reportaram a detecção de M. genitalium em 8,4% das amostras de líquido obtido da cavidade abdominal de mulheres, prevalência menor que a observada no presente estudo. Estudo realizado por Manhart et al., (2004) reportaram a prevalência de 16% em amostras de biópsia de endométrio de mulheres co m endometrite aguda (MANHART, et al., 2004). Outro estudo realizado por Ashshi et al., (2015), por sua vez, detectaram M. genitalium (14,1%) nas tubas uterinas de mulheres que tiveram gravidez ectópica. Estes relatos associados aos resultados obtidos por Baczynska et al., (2007), ao descreverem a capacidade de M. genitalium de se aderir ao epitélio da tuba uterina mostram que o microrganismo é capaz de infectar o trato reprodutivo superior. Com sua capacidade de gerar infecções, muitas vezes oligossintomát icas nestes sítios anatômicos, tratamento mais adequado não é oferecido às pacientes (GRZESKO et al., 2009) . Assim, sugerimos que a capacidade inerente à patogênese das infecções provocadas por M. genitalium façam com que este persista por mais tempo no tr ato reprodutivo superior e, assim, seja carreado para a cavidade peritoneal durante a menstruação retrógrada com maior facilidade. Este contexto justificaria sua detecção na cavidade peritoneal e não necessariamente em concomitância com a detecção no swab endocervical. Além disso, a detecção de M. genitalium nas amostras de fluido peritoneal, também foi associada ao sintoma dismenorreia, quando independente da nota de dor referida pelo paciente (p < 0,05) (Dado não mostrado). Outros estudos descreveram associação deste microrganismo com diferentes sintomas e condições como a ocorrência de doença inflamatória pélvica (DIP) (HAGGERTY; TAYLOR, 2011), corrimento vaginal (KORTE et al., 2006; WALKER et al., 2011), uretrite (MOI et al., 2009) e cervicite (FALK et al., 2005; JENSEN, 2004) . Por outro lado, não há menção da associação entre a infecção por M. genitalium com sintomas como dor pélvica, sinusiorragia e dispareunia (KORTE et al., 2006; SHORT et al., 2010) . Esta inespecificidade e inconsistência entre a d etecção de M. genitalium e os sintomas e condições 109 clínicas associadas contribui para que este panorama ainda dificulte a observação clínica. Apesar dos fortes indícios de reações à infecção causada por M. genitalium e da reconhecida capacidade de gerar infecção persistente no hospedeiro, o diagnóstico, e, consequentemente, tratamento das infecções podem ser negligenciados em grande parte pela infecção subclínica e assintomática. Em consequência, dificulta-se a determinação de eventos como a infertilidade e doença inflamatória pélvica (HAGGERTY; TAYLOR, 2011; JENSEN, 2004; KRAUSE et al., 1982). O reconhecimento de que o HPV é causa necessário do câncer de colo uterino abriu a possibilidade para novas estratégias de prevenção, incluindo a prevenção primária com uso de vacina altamente efetivas e a prevenção secundária com uso de testes altamente sensíveis, o que tem melhorado significativamente a performance de programas de screening baseados no teste de Papan icolaou. Técnicas moleculares tê m sido consideradas alternativas melhores do que a citologia por conta da sensibilidade e reprodutibilidade em detectar NIC 2 e NIC 3. Apesar disto da reconhecida importância dos testes de DNA para HPV na prevenção do câncer de colo uterino, estes ainda nã o são uma rotina no Brazil (LORENZI; SYRJÄNEN; LONGATTO-FILHO, 2015). De forma interessante, observamos no presente estudo que a detecção de HPV no fluido peritoneal foi maior em mulheres do grupo caso (nove pacientes) do que no grupo controle (uma pacien te). Estudo realizado por Vestergaard et al., (2010) reportou prevalência de 5,8% das amostras de endométrio eutópico de mulheres com (1/32) e sem endometriose (2/20) e nenhuma amostra positiva nas lesões endométrio ectópico em ambos os grupos. Diferentemente, os resultados do presente estudo foram similares ao descrito por Oppelt et al., (2010) . Ambos detectaram HPV em amostras de lesão de endometriose ou peritônio sadio. Detectamos HPV em 3,1% das amostras testadas, enquanto que no estudo alemão 11,3% das lesões foram positivas para HPVs de médio e alto risco. De forma similar, também foi sugerido pelos autores que o fenômeno da menstruação seria a principal causa dos achados. Sugeriu - se ainda que a infecção persistente causada por HPV poderia contribuir p ara a evolução da malignidade celular localmente. A microbiota vaginal “normal” de mulheres, baseado no perfil mais recorrente em mulheres saudáveis, é entendida como aquela que contém altas 110 proporções de Lactobacillus sp. Alterações da microbiota normal vaginal podem ocorrer principalmente pelo ciclo menstrual e atividade sexual. Desta maneira, susceptibilidade por infecções no trato genital pode aumentar pela flutuação da microbiota vaginal (GAJER et al., 2012) . Neste contexto, ao avaliar o risco de colonização microbiana intrauterina e a ocorrência de endometrite em mulheres com endometriose, Khan et al., (2014) reportaram alta colonização microbiana na cavidade uterina em mulheres com endometriose. Os autores associam o achado ao uso de tratamento com agonistas de GnRH (GnRHa). Cinco grupos microbianos mais prevalentes perfazem a maior parte da microbiota vaginal. Dentre estes, os quatro primeiros são essencialmente formados por Lactobacillus sp. (Lactobacillus iners, L. crispatus, L. gasseri, or L. jensenii). O último grupo é composto por altas proporções de organismos anaeróbicos (RAVEL et al., 2011). No presente estudo, o perfil de coinfecção entre os grupos apresentou diferença estatisticamente significante entre si (p < 0,05). O perfil de coinfecção observado nas amostras de swab endocervical e fluido peritoneal mostrou maior diversidade de padrões de coinfecção quando comparado ao grupo controle. Como abordado, anteriormente, o fato da maior parte das mulheres estarem em uso d e terapia hormonal pode ter contribuído para a que as mulheres estivessem mais vulneráveis à infecção por diferentes microrganismos simultaneamente (KHAN et al., 2014). Em mulheres com endometriose, alterações funcionais em células do sistema imune (macró fagos, NK, Linfócitos T citotóxicos e talvez neutrófilos), torna o microambiente peritoneal mais imunotolerante , permitindo o estabelecimento da doença após a menstruação retrógrada. Além disso, a produção de várias citocinas e quimiocinas por diferentes c élulas podem favorecer a progressão da doença em detrimento da prevenção (HERINGTON et al., 2011). No presente estudo, na dosagem de citocinas no fluido peritoneal dos grupos caso e controle, infectados ou não por Mollicutes, observou-se que houve diferença estatisticamente significante entre os grupos para as citocinas IFN -γ, IL-1β e IL-6. Em concordância com estudo realizado por Bersinger et al., (2012), a dosagem de IL -6 no fluido peritoneal esteve aumentada no grupo caso em comparação ao grupo controle. Além disso, a concentração de IL -6, tanto no fluido peritoneal quando no soro, pode ser usado como um biomarcador, devido 111 a sua relação positiva com o estágio da doença (MOSBAH; NABIEL; KHASHABA, 2016). O grupo caso quando infectado por M. genitalium (EDT + MG) também apresentou alta produção de IL -6 comparado ao grupo controle. Entretanto, a concentração de IL-6 foi menor no grupo caso infectado denotando que M. genitalium é capaz de modular a resposta imune nas mulheres com endometriose, diminuindo a produção de IL-6 localmente. McGowin et al., (2012) verificaram que M. genitalium provoca alta produção de IL-6 em células A2EN e ShEN101 (humanos) durante a fase aguda (48 h). No entanto, em infecção persistente de até 36 dias, observou -se níveis insignificantes dessa citocina . Resultados semelhantes foram observados por Campos et al., (2015), onde IL- 6 apresentava maior em mulheres sadias do que em mulheres infectadas por M. genitalium. No presente estudo, a produção de IL-1β estava aumentada nas mulheres do grupo caso infectadas por MG (EDT + MG), com diferença significante para o grupo controle e para o grupo caso não infectado (p < 0,05). Não houve diferença entre o grupo caso não infectado (EDT) e o controle (CN) sugerindo que a infecção por M. genitalium tenha sido determinante para a maior produção da citocina. Diversos autores reportam maior produção de IL-1β nas mulheres com endometriose (BERBIC; FRA SER, 2011; SIKORA et al., 2011; SIKORA; MIELCZAREK-PALACZ; KONDERA-ANASZ, 2016), no entanto, outros não tem observado diferença na concentração de IL -1β entre mulheres com e sem endometriose (BARCZ et al., 2012; MOSBAH et al., 2016) . A presença ou não de micro-organismo pode ser um dos motivos pelo qual os resultados são discrepantes entre os autores. Da mesma forma que IL-1β, a produção de IFN-γ foi maior no grupo caso infectado por M. genitalium (EDT + MG), reforçando a hipótese de que o microrganismo tenha sido o gatilho para a produção aumentada da citocina nas mulheres com endometriose. Essa característica pode estar relacionada com o padrão molecular associado aos patógenos (PAMPS) presentes no micoplasmas. Os molicutes possuem grande número de lipoproteínas, chamadas de “ lipid-associated membrane proteins ” (LAMPs). O reconhecimento das LAMPs pel o sistema imune inato pode induzir a produção de várias citocinas pró -inflamatórias (GARCIA et al., 1998; KACEROVSKY et al., 2013; VISCARDI, 2014). 112 Nas amostras de tecido de biópsia, cinco citocinas apresentaram níveis elevados (IFN-γ, IL-18, IL-13, TNF-α e IL-23) no grupo controle infectado com M. genitalium (CN + MG) quando comparado ao grupo controle não infectado (CN) (p < 0,05). Entre estas citocinas, TNF-α destaca-se pelo papel chave no início da cascata de citocinas na resposta às infecções por M. genitalium (HE et al., 2014) e por estar aumentada no fluido peritoneal de mulheres com endometrios e (HERINGTON et al., 2011; KRALICKOVA; VETVICKA, 2015) . Todavia, no presente estudo, esta citocina não estava aumentada nas pacientes do grupo caso (EDT), apenas nas amostras de tecido do grupo controle infectado. A interleucina 18, por sua vez, reconhecida como um membro da família da IL-1, é entendida como importante reguladora da imunidade inata e adquirida. Esta citocina estava aumentada nas pacientes controle infectadas por M. genitalium (CAUCI et al., 2002). De forma similar, estavam as citocinas IL-13, normalmente vinculada a ativação de linfócitos B e monócitos em resposta similar à ativação por IL-4 (PODGAEC et al., 2007) e IL-23. Não houve alta produção das citocinas listadas no grupo caso (EDT) e isso po de ter ocorrido devido o estado de regulação negativa de células do sistema imune nas mulheres com endometriose com menor responsividade aos estímulos das citocinas (HERINGTON et al., 2011). Na expressão gênica, quando comparadas as amostras de tecido os grupos caso (EDT) e controle (CN), sem infecção por micoplasmas, foi verificada alta expressão de genes ligados à ativação da resposta inflamatória (como Toll- likes – TLR1, TLR2 e TLR8 – CASP1, IL1R1, IL1B e CRP), à ativação de macrófagos ( IFNG), à ativaçã o do sistema complemento ( APCS) e à apresentação de antígeno ( CD86). Estes achados demonstram de forma evidente o processo inflamatório que se estabelece nas lesões de endometriose estudadas. Esse perfil inflamatório no tecido da lesão da endometriose também foi observado por Ahn et al., (2016), onde os autores relacionam como esse perfil sendo fundamental para o processo de proliferação, sobrevivência e diferenciação dessas células. Luo et al., (2015) sugerem que os TLRs podem desempenhar um papel importante na origem e desenvolvimento da endometriose, onde a inflamação promovida induz a secreção de IL-8 (autócrina e pará crina), que permite a invasão e a proliferação do tecido na cavidade peritoneal via sinalização de FAK (Quinase de Adesão Focal). Apesar de não ter 113 sido observada a expressão gênica em tecido do grupo caso (EDT) e/ou controle (CN) infectados por micoplasmas, é válido ressaltar que TLR2 esteve em upregulation quando comparados os tecidos dos grupos caso e controle sem infecção e essa molécula é reconhecida como o principal componente de ativação da resposta inflamatória para molicutes (BROWNING et al., 2011) . O reconhecimento de M. genitalium foi relacionado com a ativação tanto de TLR2 quanto de TLR1 (MCGOWIN et al., 2009; SHIMIZU; KIDA; KUWANO, 2008). No entanto, He et al., (2009) observaram que a infecção por M. genitalium pode também necessitar da ativação, além de TLR1 e TLR2, de TLR6 para mediar o processo inflamatório relacionado a essa bactéria. No entanto, a o avaliar a expressão gênica n as células do fluido, foi observado perfil de downregulation de genes ligados à ativação de resposta inflamatória (NLRP3), apresentação de antígeno e integrinas ( ITGAM e CD80), fator de ativação de macrófagos ( SLC11A1), mostrando que existe um perfil de inibição das células recrutadas ao local. Macrófagos, Linfócitos T, B e NK, neutrófilos e células dendríticas são as principais células presentes no fluido peritoneal (KRALICKOVA; VETVICKA, 2015) . Este perfil de expressão é condizente com os relatos da literatura de que as diferentes células do sistema imune, sobretudo macrófagos e linfócitos T ativados, são recrutadas, no entanto, essas células são pouco responsivas devido à baixa expressão de receptores essenciais às funções de reconhecimento, apresentação e ativação celular (HERINGTON et al., 2011) . No caso de linfócitos, e stes efeitos imunossupressores não estão correlacionados com período menstrual e nem com níveis de estradiol, progesterona ou prostaglandina E2 (OOSTERLYNCK et al., 1993). Esse processo pode estar relacionado à inibição da apoptose. Kang et al. , (2014) observaram que o aumento na concentração de IL-6 no fluido peritoneal de mulheres com endometriose , diminui a a tividade citolítica de células NK pela downregulation de grânulo, sendo esse papel regulado pela expressão de SHP-2 (tirosino-fosfatase Shp2). Além disso, na endometriose, apesar de haver aumento no número de macrófagos recrutados, esses são não responsivos, principalmente devido à inibição de ICAM-1. Isto pode levar à imunotolerância ao tecido implantado (MAEDA, et al., 2002). De forma bastante interessante, e sse perfil é acentuado com a presença de M. genitalium . Na análise de expressão gênica em células do fluido com M. genitalium foi percebida 114 acentuada downregulation de genes ligados à ativação de resposta inflamatória (TYK2, STAT1, CD14), ativação de resposta TH1 (TBX21), ativação de resposta TH2 (IL5), além da apresentação de antígeno ( HLA-A, CD86). Além disso, ao agruparmos todos os micop lasmas e comparamos a expressão gênica nas células do fluido peritoneal do grupo caso infectado com micoplasmas; com o grupo controle sem micoplasmas, de forma geral, os mesmos tipos de genes estavam em downregulation (TBX21, MAPK8, IRAK1 – receptor de IL-1, IFNGR1 – receptor de INFG; e HLA-A e CDA4 – reconhecimento do MHC). Não se sabe ao certo, de que maneira esses micro -organismos são capazes de induzir essa imunotolerância; no entanto, alguns micoplasmas, como M. genitalium , são capazes de persistir no hospedeiro por mecanismos de imunomodulação (BROWNING et al., 2011) . M. genitalium é capaz de sobreviver durante longos períodos de infecção, independente da ativação de resposta inflamatórias crônicas. No entanto esse mecanismo ainda é desconhecido (MCGOWIN et al., 2012). Em contrapartida, quando o microrganismo detectado nas amostras de fluido foi M. hominis, ocorreu um perfil inverso de expressão com acentuada upregulation de diferentes genes ( STAT6, MAPK1, IRF3 e GATA3) de forma significante (p < 0,05). O gene GATA3 foi descrito como uma molécula que sofre influência direta do hormônio estrógeno e pode promover a ocorrência e desenvolvimento da endometriose por meio da regulação da secreção de citocinas (IL-6, IL-10 e IL-8) em células do endométrio eutópico de pacientes com endometriose (CHEN; WANG; LIANG, 2016) . Da mesma maneira, ainda é incerto o papel imunomodulatório de M. hominis (HASEBE; MU; COLE, 2014). Diante dos resultados obtidos, propõe -se que a endometriose, independente da presença de Mollicutes, é capaz de induzir a secreção de citocinas inflamatórias no fluido peritoneal, levando a um ambiente pró - inflamatório. O estado inflamatório gerado induz o recrutamento de células do sistema imune. Contudo, essas não são funcionais, o que leva a uma tolerância ao tecido implantado . A presença de micoplasmas, em especial M. genitalium, no fluido peritoneal, pode desempenhar um papel chave na manutenção desse processo de imunotolerância e, principalmente, no agravamento desse perfil. No entanto, mais estudos são necessários para compreender essa imunotolerância frente às infecções bacterianas. Os dados obtidos no presente estudo são inéditos e importantes para favorecer a discussão quanto à importância e 115 relevância que as espécies de micoplasmas e outros microrganismos de importância clínica ginecológica podem representar na saúde sexual e reprodutiva da mulher. 116 7 CONCLUSÕES  Mulheres com alto grau de instrução (≥ ensino superior completo) compuseram o perfil estatisticamente mais associado à endometriose.  Os sintomas dismenorreia e dispareunia apresentaram estatisticamente maior severidade (EAD ≥ 7) nas mulheres com endometriose . Além destes, infertilidade foi outra queixa estatisticamente mais frequente nas mulheres com endometriose.  Espécies de Mollicutes (M. genitalium, M. hominis e U. urealyticum) e HPV podem ser detectadas por meio da qPCR em amostras clínicas obtidas da cavidade peritoneal de mulheres com endometriose.  As mulheres com endometriose apresentaram maior diversidade de microrganismos detectados nas amostras e fluido peritoneal ( M. genitalium, M. hominis e U. urealyticum ) e tecido de biópsia ( M. genitalium, M. hominis e HPV) quando comparado ao grupo controle.  A prevalência dos microrganismos detectados (M. genitalium, M. hominis, U. urealyticum e HPV) nas amostras de swab endocervical e fluido peritoneal foi maior nas mulheres com endometriose que nas mulheres controle. Nas amostras de tecido, a prevalência de M. genitalium e M. hominis foi maior dentre as mulheres com endometriose.  A menstruação retrógrada pode explicar, em parte, a tendência decrescente da prevalência dos microrganismos detectados nas amostras clínicas na ordem Swab > Fluido peritoneal > Tecido de biópsia, nos grupos caso e controle.  A detecção de U. parvum nas amostras de swab endocervical foi associada estatisticamente com a maior severidade do sintoma dispareunia.  A detecção de M. genitalium no fluido peritoneal de mulheres com endometriose foi associada à maior pr odução de IFN -γ e IL -1β, quando comparado aos grupos caso e controle sem este micoplasma.  A maior produção de IL -6 no fluido peritoneal foi associada às mulheres com endometriose com ou sem M. genitalium. 117  A infecção por M. genitalium foi associada à maior produção das citocinas IFN-γ, IL-18, IL-13, TNF-α e IL-23 no tecido de biópsia do grupo controle, quando comparado ao grupo controle não infectado.  Houve aumento na produção de TNF-α no tecido de biópsia de mulheres com endometriose e M. genitalium e não nas mulheres do grupo caso sem infecção.  Houve alta expressão de genes ligados à ativação da resposta inflamatória, ativação de macrófagos, do sistema complemento e apresentação de antígeno nas lesões de endometriose não infectadas com micoplasmas.  Não houv e diferença entre a expressão gê nica de genes ligados à resposta imune à inflamação nas lesões de endometriose de mulheres com ou sem M. genitalium.  Nas células presentes no fluido peritoneal de mulheres com endometriose sem infecção foi observado perfil de downregulation de genes ligados à resposta inflamatória, apresentação de antígenos, fator de ativação de macrófagos, o q ue pode estar ligado à imunotolerância ao tecido implantado.  O perfil de downregulation de genes da inflamação e resposta imune, nas células presentes no fluido peritoneal, foi acentuado pela presença de M. genitalium ou qualquer micoplasma . No entanto, na presença de M. hominis foi observado um perfil contrário.  Células do f luido peritoneal de mulheres com endometriose, infectadas por qualquer micoplasma , apresentaram prevalência do perfil de downregulation dos genes ligados à resposta imune inflamatória comparado ao grupo controle sem infecção.  A presença de micoplasmas, em especial M. genitalium , no fluido peritoneal, pode desempenhar papel chave na manutenção do processo de imunotolerância, principalmente pelo agravamento desse perfil. 118 REFERENCIAS* ABELE-HORN, M.; WOLFF, C.; DRESSEL, P.; ZIMMERMANN, A.; VAHLENSIECK, W.; PFAFF, F.; RUCKDESCHEL, G. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., v. 15, n. 7, p. 595-598, 1996. ABRAO, M. S.; GONCALVES, M. O.; DIAS, J. A., JR.; PODGAEC, S.; CHAMIE, L. P.; BLASBALG, R. 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EDT LSN Ex. de lesão de endometriose DNA Ex, de endometriose retrocervical + Salpingectomia PSO Ex. focos de endometriose KBCB Videolaparoscopia para Ex. de EDT SMRJ Ex. de lesão retrocervical + histerectomia RSO Ressecção de focos peritoneais + Miomectomia VLP AEN Ex. lesão EDT superficial e retrocervical EM Ressecção de lesão de endometriose AP Videolaparoscopia para Ex. de lesões de Endometriose RCMG Histerectomia total + Ex. EDT retrocervical JCS Histerectomia total + Salpingectomia bilateral AV Ex. de endometriose de peritônio CRN Ex. de focos de EDT CT Histerectomia videolaparoscópica + apendicectomia NGO Ex. lesão endometriose útero-sacra LPFB Ex. Endometriose retrocervical e vagina SKIM Ex. lesão útero-sacra 143 APÊNDICE A – Tipo de cirurgia realizada por grupo de estudo Pacientes do Grupo Caso Iniciais Cirurgia SRC Salpingectomia + Ooforoplastia + Miomectomia EMNV Videolaparoscopia diagnóstica + Salpingectomia bilat. DRM Histerectomia total CPS Ex. de lesões de endometriose CFS Ex. lesão de vagina e útero-sacra direita GARH Ex. lesões de endometriose TVA Ex. lesão de EDT parauretral esquerda + cistectomia LGP Ex. de lesões de endometriose MCCC Ex. de lesão retrocervical e de fossa ovárica esquerda JMO Lise de aderências e ressecção de EDT retrocervical BMAB Ex. de lesões de endometriose ESF Ex. de lesões de endometriose CSA Ex. de lesão perivesical + Ureterólise bilateral AFA Ressecção de lesão retrocervical + lise de aderências ATTT Ex. de lesão de vagina, retrocervical e paravesical CBA Lise de aderências + Ex. de lesão retrocervical MMMPM Histerectomia total + Salpingectomia bilateral VSL Ex. lesões de EDT em fossa ovárica CCLS Laparoscopia histerectomia total BBAVO Ex. lesão de EDT + miomectomia ZBR Ex. de lesões de endometriose ALMM Ooferectomia esq. + Ex. de EDT paravesical esquerda JNF Ex. lesões de vagina e fossa ovárica esquerda TCN Ex. de lesões de endometriose MFC Miomectomia + Ex. lesão retrocervical DPR Histerectomia total + Salpingectonia GTBV Histerectomia total + Salpingectomia ECGE Ex. lesão de EDT LFT Laqueadura tubárea + Ex. lesão superficial de EDT 144 APÊNDICE B – Ficha de atendimento ginecológico ambulatorial UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS MESTRADO EM MICROBIOLOGIA FICHA DE ATENDIMENTO GINECOLÓGICO NÚMERO: DATA: UNIDADE DE SAÚDE: NOME (Apenas Iniciais): IDADE (Anos): ESCOLARIDADE REGIÃO: 1. RURAL 2. URBANA ANO DO ÚLTIMO EXAME RAÇA/COR: 1. BRANCA 2. PRETA 3. AMARELA 4. PARDA 5. INDÍGENA MOTIVO DA CONSULTA: HISTÓRIA MENSTRUAL MENARCA ANOS DATA DA ÚLTIMA MENSTRUÇÃO HISTÓRIA SEXUAL IDADE DO 1 ⁰ INTERCURSO SEXUAL VIDA SEXUAL ATUAL 1. ATIVA 2. INATIVA RELAÇÃO ESTÁVEL 1. SIM 2. NÃO LIBIDO 1. MANTIDA 2. PRESENTE 3. DIMINUÍDA 4. AUMENTADA ORGASMO 1. FREQUENTE 2. RARO 3. NUNCA NÚMERO DE PARCEIROS NA VIDA 1. UM 2. 2 A 5 3. 6 A 9 4. 10 OU MAIS NÚMERO DE PARCEIROS (ÚLT. 3 MESES) 1. UM 2. DOIS 3. TRÊS 4. QUATRO OU MAIS DISPAREUNIA 1. SIM 2. NÃO SINUSIORRAGIA 1. SIM 2. NÃO PRESERVATIVO 1. SIM SEMPRE 2. AS VEZES 3. RARAMENTE 4. NÃO NUNCA COMO USA? (SOLICITAR DESCRIÇÃO DO USO) 1. CORRETAMENTE 2. INCORRETAMENTE MÉTODO ANTICONCEPCIONAL TEMPO DE USO DE ANTICONCEPCIONAL HISTÓRICO OBSTÉTRICO NÚMERO DE GESTAÇÕES ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PROVOCADOS PARTOS PREMATUROS A TERMO NATURAIS A TERMO ARTIFICIAIS ANTECEDENTES PATOLÓGICOS DST 1. PRÉVIA E TRATADA 2. DESCONHECE OU NEGA 3. PRÉVIA E NÃO TRATADA HIV 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE SINTOMATOLOGIA 1. CORRIMENTO 1. SIM 2. NÃO 2. DISÚRIA 1. SIM 2. NÃO 3. ODOR 1. FÉTIDO 2. CARACTERÍSTICO 4. DOR PÉLVICA 1. SIM 2. NÃO 5. PRURIDO 1. SIM 2. NÃO 6. HIPEREMIA 1. SIM 2. NÃO 7. VERRUGA 8. BOLHA/VESÍCULA 9. FERIDA/ÚLCERA 145 1. SIM 2. NÃO 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 10. PETÉQUIAS 1. SIM 2. NÃO OUTRO 1. PARCEIRO/SINTOMATOLOGIA 1.1QUEIXA 1. SIM 2. NÃO 1.2 HIPEREMIA 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.3 CORRIMENTO ANORMAL 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.4 VERRUGA 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.5 BOLHA 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.6 DISÚRIA 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.7 PRURIDO 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE 1.8 DISPAREUNIA 1. SIM 2. NÃO 3. NÃO SABE OUTRO TRATAMENTO PARA MENOPAUSA 1. SIM 2. NÃO ESTROGENIZADA PARA PAPANICOLAU 1. SIM 2. NÃO 146 HISTÓRIA DE TRATAMENTO ANTERIOR COMPRIMIDO 1. SIM 2. NÃO CREME VAGINAL 1. SIM 2. NÃO TEMPO 1. 1 SEMANA 2. 2 SEMANAS 3. MAIS DE 2 SEMANAS INJEÇÃO 1. SIM 2. NÃO PARCEIRO TRATADO 1. SIM 2. NÃO RELAÇÃO SEXUAL NO TRATAMENTO 1. SIM COM CONDON 2. SIM SEM CONDON 3. NÃO 2. PARCEIRO/TRATAMENTO 2.1 SABE INFORMAR 1. SIM 2. NÃO 2.2 PARCEIRO TRATADO 1. SIM 2. NÃO 2.3 TIPO DO TRATAMENTO 1. COMP. 2. POMADA 3. INJEÇÃO 2.4 TRATAMENTO CONCOMITANTE C/ PARCERIA 1. SIM 2. NÃO EXAME GINECOLÓGICO ACHADOS EM GENITÁLIA EXTERNA 1. VESÍCULA 2. VERRUGA 3. ÚLCERA 4. BOLHA 5. PETÉQUIAS 6. ODOR 7. OUTRO (Descrever) ACHADOS EM GENITÁLIA INTERNA 1. MUCOPUS ENDOCERVICAL 2. CORRIMENTO VAGINAL 3. COLO FRIÁVEL 4. MASSA ANORMAL DE TECIDO NO COLO 5. OUTROS (Descrever): CONDUTA ___/___/___ ______________________________________________ DATA ASSINATURA E CARIMBO 147 APÊNDICE C – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras swab endocervical de acordo com o uso de hormônio Nota: Perda de observação: 13; n= 91. *Teste de verossimilhança. Legenda: SIU-LNG: Sistema Intrauterino Liberador de Levonorgestrel; ND: Não definida Método Contraceptivo Distribuição (%) entre casos e controles para amostras de swab endocervical M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* Nenhum ACO/Injetável SIU-LNG 7 (58,3) 47 (59,5) 1,00 0,605 22 (57,9) 32 (60,4) 1,00 0,911 6 (85,7) 48 (57,1) 1,00 0,438 8 (53,3) 46 (60,5) 1,00 0,783 4 (33,3) 30 (38,0) 3,35 [0,26; 42,07] 15 (39,5) 19 (35,8) 0,87 [0,36; 2,07] 1 (14,3) 33 (39,3) 4,12 [0,47; 35,87] 7 (46,7) 27 (35,5) 0,67 [0,21; 2,05] 1 (8,3) 2 (2,5) 3,75 [0,27; 51,37] 1 (2,6) 2 (3,8) 1,37 [0,11;16,11] 0 (0) 3 (3,6) ND - 0 (0) 3 (3,9) ND - 147 148 APÊNDICE D – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras de fluido peritoneal de acordo com o uso de hormônio Nota: Perda de observação: 32; n = 72. *Teste de verossimilhança. Legenda: SIU-LNG: Sistema Intrauterino Liberador de Levonorgestrel; ND: Não definida Método Contraceptivo Distribuição (%) entre casos e controles para amostras de fluido peritoneal M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* Nenhum ACO/Injetável SIU-LNG 17 (70,8) 28 (58,3) 1,00 0,775 12 (75,0) 33 (58,9) 1,00 0,649 1 (50,0) 44 (62,9) 1,00 0,903 0 (0) 45 (62,5) ND - 7 (29,2) 17 (35,4) 1,47 [0,50; 4,28] 4 (25,0) 20 (35,7) 1,81 [0,51; 6,41] 1 (50,0) 23 (32,9) 0,52 [0,03; 8,74] 0 (0) 24 (33,3) ND - 0 (0) 3 (6,2) ND - 0 (0) 3 (5,4) ND - 0 (0) 3 (4,3) ND - 0 (0) 3 (4,2) ND - 148 149 APÊNDICE E – Perfil de prevalência dos Mollicutes nas amostras de tecido de biópsia de acordo com o uso de hormônio Nota: Perda de observação: 13; n = 91. *Teste de verossimilhança. Legenda: SIU-LNG: Sistema Intrauterino Liberador de Levonorgestrel; ND: Não definida Método Contraceptivo Distribuição (%) entre casos e controles para amostras de tecido de biópsia M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* Nenhum ACO/Injetável SIU-LNG 5 (50,0) 50 (61,7) 1,00 0,692 2 (50,0) 53 (60,9) 1,00 0,872 0 (0) 55 (60,4) ND - 0 (0) 55 (60,4) ND - 5 (50,0) 28 (34,6) 0,56 [0,14; 2,10] 2 (50,0) 31 (35,6) 0,58 [0,78; 4,36] 0 (0) 33 (36,3) ND - 0 (0) 33 (36,3) ND - 0 (0) 3 (3,7) ND - 0 (0) 3 (3,4) ND 0 (0) 3 (3,3) ND - 0 (0) 3 (3,3) ND - 149 150 APÊNDICE F – Perfil de prevalência de HPV por amostra clínica e N. gonorrhoeae nas amostras de swab de acordo com o uso de hormônio. Nota: Perda de observação (HPV - Swab): 16; n = 88; Perda de observação (HPV – Fluido Peritoneal): 34; n = 70; Perda de observação (HPV – Tecido de Biópsia): 14; n = 90. Nota: Perda de observação (N. gonorrhoeae): 10; n = 94. *Teste de verossimilhança Legenda: SIU-LNG: Sistema Intrauterino Liberador de Levonorgestrel; ND: Não definida Método Contraceptivo n (%) Distribuição (%) entre casos e controles - Amostra por Microrganismo HPV N. gonorrhoeae Swab endocervical Fluido peritoneal Biópsia de tecido Swab endocervical qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* qPCR Positivo n (%) qPCR Negativo n (%) OR IC 95% p* Nenhum ACO/Injetável SIU-LNG 1 (20,0) 51 (61,4) 1,00 0,232 3 (60,0) 40 (61,5) 1,00 0,980 3 (100) 52 (59,8) 1,00 - 2 (100) 55 (59,8) 1,00 - 4 (80,0) 29 (34,9) 0,14 [0,01; 1,33] 2 (40,0) 22 (33,8) 0,82 [0,12; 5,31] 0 (0) 32 (36,8) ND - 0 (0) 34 (37,0) ND - 0 (0) 3 (3,6) ND - 0 (0) 3 (4,6) ND - 0 (0) 3 (3,4) ND - 0 (0) 3 (3,3) ND - 150 151 APÊNDICE G – Prevalência de coinfecção de Mollicutes (M. hominis , M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum ), HPV e N. gonorrhoeae em amostras de swab endocervical de mulheres com e sem endometriose, São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1. Microrganismos Caso (EDT) (n = 73) n (%) Controle (n = 31) n (%) Total (n = 104) n (%) MG +MH 6 (8,2) 2 (6,4) 8 (7,7) MG + UU 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) MH + UU 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) MH + UP 4 (5,5) 1 (3,2) 5 (4,8) UU + UP 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) MG + MH + UP 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) MG + MH + UP + UU 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) MG + MH + UU + HPV 1 (1,4) 0 (0) 1 (1,0) Total de mulheres com coinfecção 16 (21,9) 3 (9,7) 19 (18,3) Legenda: MG = Mycoplasma genitalium , MH = Mycoplasma hominis , UU = Ureaplasma urealyticum, UP = Ureaplasma parvum , HPV = Papilomavírus humano. n = 104 (número absoluto de amostras testadas). Nota: em negrito, estão em destaque as coinfecções mais frequentes 152 APÊNDICE H – Prevalência de coinfecção de micoplasmas genitais (M. hominis, M. genitalium , U. urealyticum e U. parvum ) em amostras de fluido peritoneal de mulheres com e sem endometriose , São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1. Microrganismos Caso (EDT) (n = 54) n (%) Controle (n = 24) n (%) Total (n = 78) n (%) MG +MH 6 (11,1) 1 (4,2) 7 (9,0) MG + HPV 3 (5,6) 0 (0) 3 (3,8) MH + HPV 1 (1,9) 0 (0) 1 (1,3) MG + MH + UU 1 (1,9) 0 (0) 1 (1,3) MG + MH + HPV 1 (1,9) 0 (0) 1 (1,3) Total de mulheres com coinfecção 11 (20,4) 1 (4,2) 12 (15,4) Legenda: MG = Mycoplasma genitalium , MH = Mycoplasma hominis , UU = Ureaplasma urealyticum, UP = Ureaplasma parvum , HPV = Papilomavírus humano. n = 78 (número absoluto de amostras testadas). Nota: em negrito, estão em destaque as coinfecções mais frequentes. 153 APÊNDICE I – Prevalência de coinfecção de micoplasmas genitais ( M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum e U. parvum) em amostras de tecido de biópsia de mulheres com e sem endometriose, São Paulo - SP, 2014.2 – 2015.1. Microrganismos Caso (EDT) (n = 68) n (%) Controle (n = 30) n (%) Total (n = 98) n (%) MG + MH 0 1 (3,3) 1 (1,0) MG + HPV 1 (1,5) 0 1 (1,0) Total de mulheres com coinfecção 1 1 2 (2,0) Legenda: MG = Mycoplasma genitalium , MH = Mycoplasma hominis , UU = Ureaplasma urealyticum, UP = Ureaplasma parvum , HPV = Papilomavírus humano. n = 98 (número absoluto de amostras testadas). 154 APÊNDICE J – Detecção de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Nota: Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 32 (n = 72); 2Dos pélvica cíclica: perda de 32 (n = 72); 3Dispareunia: perda de 33 (n = 71); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 32 (n = 72); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 32 (n = 72); 6Infertilidade: perda de 33 (n = 71) *Significância estatística quando p < 0,05 *Teste de Qui-quadrado ɸ Teste de Fisher ND: Não definida Sintomas Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de Fluido Peritoneal M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* Dismenorreia (EAD), n (%)1 ≥ 7 < 7 17 (70,8) 31 (64,6) 1,33 [0,46, 3,84] 0,596 10 (62,5) 38 (67,9) 0,78 [0,24; 2,51] 0,688 1 (50,0) 47 (67,1) 0,48 [0,02; 8,18] 1,000 0 (0) 48 (66,7) ND - - 7 (29,2) 17 (35,4) 6 (37,5) 18 (32,1) 1 (50,0) 23 (32,9) 0 (0) 24 (33,3) Dor pélvica cíclica (EAD), n (%)2 ≥ 7 < 7 9 (37,5) 18 (37,5) 1,00 [0,36; 2,75] 1,000 7 (43,8) 20 (35,7) 1,40 [0,45; 4,32] 0,558 0 (0) 27 (38,6) 1,04 [0,98; 1,11] 0,525ɸ 0 (0) 27 (37,5) ND - - 15 (62,5) 30, 62,5) 9 (56,2) 36 (64,3) 2 (100) 43 (61,4) 0 (0) 45 (62,5) Dispareunia (EAD), n (%)3 ≥ 7 < 7 9 (39,1) 23 (47,9) 0,69 [0,25; 1,92] 0,486 5 (31,2) 27 (49,1) 0,47 [0,14; 1,53] 0,207 1 (50,0) 31 (44,9) 1,22 [0,07; 20,40] 1,000 0 (0) 32 (45,1) ND - - 14 (60,9) 25 (52,1) 11 (68,8) 28 (50,9) 1 (50,0) 38 (55,1) 0 (0) 39 (54,9) Alt. intest. cíclicas (EAD), n (%)4 ≥ 7 < 7 5 (20,8) 12 (25,0) 0,78 [0,24; 2,57] 0,695 3 (18,8) 14 (25,0) 0,69 [0,17; 2,78] 0,604 0 (0) 17 (24,3) 1,03 [0,98; 1,09] 1,000ɸ 0 (0) 17 (23,6) ND - - 19 (79,2) 36 (75,0) 13 (81,2) 42 (75,0) 2 (100) 53 (75,7) 0 (0) 55 (76,4) Alt. urin. cíclicas (EAD), n (%)5 ≥ 7 < 7 6 (25,0) 5 (10,4) 2,86 [0,77; 10,60] 0,203 0 (0) 11 (19,6) 1,35 [1,26; 1,57] 0,108ɸ 0 (0) 11 (15,7) 1,03 [0,98; 1,08] 1,000 0 (0) 11 (15,3) ND - - 18 (75,0) 4 (89,6) 16 (100) 45 (80,4) 2 (100) 59 (84,3) 0 (0) 61 (84,7) Infertilidade, n (%)6 Sim Não 8 (34,8) 19 (39,6) 0,81 [0,28; 2,29] 0,697 6 (37,5) 21 (38,2) 0,97 [0,30; 3,06] 0,961 0 (0) 27 (39,1) 1,04 [0,98; 1,11] 0,522ɸ 0 (0) 27 (38,0) ND - - 15 (65,2) 29 (60,4) 10 (62,5) 34 (61,8) 2 (100) 42 (60,9) 0 (0) 44 (62,0) 154 155 APÊNDICE K – Detecção de Mollicutes em amostras de tecido de biópsia por PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Nota: Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 15 (n = 89); 2Dos pélvica cíclica: perda de 15 (n = 89); 3Dispareunia: perda de 16 (n = 88); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 14 (n = 90); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 14 (n = 90); 6Infertilidade: perda de 16 (n = 88) *Significância estatística quando p < 0,05 *Teste de Qui-quadrado ɸ Teste de Fisher ND: Não definida Sintomas Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de Tecido de Biópsia M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* Dismenorreia (EAD), n (%) ≥ 7 < 7 9 (90,0) 52 (65,8) 4,67 [0,56; 38,84] 0,234 2 (66,7) 59 (68,6) 0,91 [0,08; 10,53] 1,000ɸ 0 (0) 61 (68,5) ND - - 0 (0) 61 (68,5) ND - - 1 (10,0) 27 (34,2) 1 (33,3) 27 (31,4) 0 (0) 28 (31,5) 0 (0) 28 (31,5) Dor pélvica cíclica (EAD), n (%) ≥ 7 < 7 5 (50,0) 29 (36,7) 1,72 [0,46; 6,46] 0,415 0 (0) 34 (39,5) 1.05 [0,99; 1,12] 0,284ɸ 0 (0) 34 (38,2) ND - - 0 (0) 34 (38,2) ND - - 5 (50,0) 50 (63,3) 3 (100) 52 (60,5) 0 (0) 55 (61,8) 0 (0) 55 (61,8) Dispareunia (EAD), n (%) ≥ 7 < 7 3 (30,0) 33 (42,3) 0,58 [0,14; 2,43] 0,686 1 (33,3) 35 (41,2) 0,71 [0,06; 8,18] 1,000ɸ 0 (0) 36 (40,9) ND - - 0 (0) 36 (40,9) ND - - 7 (70,0) 45 (57,7) 2 (66,7) 50 (58,8) 0 (0) 52 (59,1) 0 (0) 52 (59,1) Alt. intest. cíclicas (EAD), n (%) ≥ 7 < 7 2 (18,2) 18 (22,8) 0,75 [0,14; 3,80] 1,000 2 (50) 18 (20,9) 3,77 [0,49; 28,69] 0,213ɸ 0 (0) 20 (22,2) ND - - 0 (0) 20 (22,2) ND - - 9 (81,8) 61 (77,2) 2 (50) 68 (79,1) 0 (0) 70 (77,8) 0 (0) 70 (77,8) Alt. urin. Cíclicas (EAD), n (%) ≥ 7 < 7 1 (9,1) 11 (13,9) 0,61 [0,07; 5,31] 1,000 0 (0) 12 (14,0) 1,05 [1,00; 1,11] 1,000ɸ 0 (0) 12 (13,3) ND - - 0 (0) 12 (13,3) ND - - 10 (90,9) 68 (86,1) 4 (100) 74 (86,0) 0 (0) 78 (86,7) 0 (0) 78 (86,7) Infertilidade, n (%) Sim Não 6 (60,0) 29 (37,2) 2,53 [0,66; 9,73] 0,165 3 (75,0) 32 (38,1) 4,87 [0,48; 48,89] 0,297ɸ 0 (0) 35 (39,8) ND - - 0 (0) 35 (39,8) ND - - 4 (40,0) 49 (62,8) 1 (25,0) 52 (61,9) 0 (0) 53 (60,2) 0 (0) 53 (60,2) 155 156 APÊNDICE L – Detecção de HPV e N. gonorrhoeae em amostras clínicas por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Variáveis Distribuição (%) entre casos e controles - Amostra por Microrganismo HPV N. gonorrhoeae Swab endocervical Fluido peritoneal Biópsia de tecido Swab endocervical qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* Dismenorreia, n (%) ≥ 7 < 7 5 (100) 55 (67,9) 0,98 [0,84; 0,98] 0,317ɸ 4 (100) 43 (66,2) 0,91 [0,83; 0,99] 0,299ɸ 1 (50,0) 59 (68,6) 0,45 [0,02; 7,59] 0,538ɸ 1 (50,0) 62 (68,9) 0,45 [0,02; 7,48] 0,533ɸ 0 (0) 26 (32,1) 0 (0) 22 (33,8) 1 (50,0) 27 (31,4) 1 (50,0) 28 (31,1) Dor pélvica cíclica, n (%) ≥ 7 < 7 4 (80,0) 31 (38,3) 6,45 [0,68; 60,39] 0,153ɸ 3 (75,0) 23 (35,4) 5,47 [0,53; 55,72] 0,147ɸ 0 (0) 33 (38,4) 1,03 [0,98; 1,09] 0,526ɸ 1 (50,0) 35 (38,9) 1,57 [0,09; 25,94] 1,000ɸ 1 (20,0) 50 (61,7) 1 (25,0) 42 (64,6) 2 (100) 53 (61,6) 1 (50,0) 55 (61,1) Dispareunia, n (%) ≥ 7 < 7 3 (75,0) 29 (35,8) 5,37 [0,53; 54,10] 0,148ɸ 2 (66,7) 29 (44,6) 2,48 [0,21; 28,76] 0,588ɸ 0 (0) 35 (41,2) 1,04 [0,98; 1,09] 0,513ɸ 1 (50,0) 36 (40,4) 1,47 [0,08; 24,30] 1,000ɸ 1 (25,0) 52 (64,2) 1 (33,3) 36 (55,4) 2 (100) 50 (58,8) 1 (50,0) 52 (59,6) Alt. Intest. cíclicas, n (%) ≥ 7 < 7 2 (40,0) 17 (20,7) 2,54 [0,39; 16,49] 0,299ɸ 2 (50,0) 15 (23,1) 3,33 [0,43; 25,71] 0,252ɸ 0 (0) 20 (23,0) 1,03 [0,98; 1,07] 1,000ɸ 1 (50,0) 19 (20,9) 3,78 [0,22; 63,41] 0,386ɸ 3 (60,0) 65 (79,3) 2 (50,0) 50 (76,9) 2 (100) 67 (77,0) 1 (50,0) 72 (79,1) Alt. Urin. cíclicas, n (%) ≥ 7 < 7 2 (40,0) 9 (11,0) 5,40 [0,79; 36,82] 0,118ɸ 1 (25,0) 10 (15,4) 1,83 [0,17; 19,44] 0,509ɸ 0 (0) 12 (13,8) 1,02 [0,99; 1,06] 1,000ɸ 0 (0) 12 (13,2) 1,02 [0,99; 1,06] 1,000ɸ 3 (60,0) 73 (89,0) 3 (75,0) 55 (84,6) 2 (100) 75 (86,2) 2 (100) 79 (86,8) Infertilidade, n (%) Sim Não 1 (20,0) 34 (43,0) 0,33 [0,03; 3,09] 0,396ɸ 1 (25,0) 25 (39,1) 0,52 [0,05; 5,28] 1,000ɸ 0 (0) 34 (40,0) 1,03 [0,98; 1,09] 0,518ɸ 0 (0) 36 (40,4) 1,03 [0,98; 1,09] 0,515ɸ 4 (80,0) 45 (57,0) 3 (75,0) 39 (60,9) 2 (100) 51 (60,0) 2 (100) 52 (59,6) 156 157 APÊNDICE L – Detecção de HPV e N. gonorrhoeae em amostras clínicas por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o perfil clínico de mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle), São Paulo – SP, 2014.2 – 2015.1. Nota 1: Amostras de Swab HPV – Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 18 (n = 86); 2Dos pélvica cíclica: perda de 18 (n = 86); 3Dispareunia: perda de 19 (n = 85); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 17 (n = 87); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 17 (n = 87); 6Infertilidade: perda de 20 (n = 84). Nota 2: Amostras de Swab N. gonorrhoeae – Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 12 (n = 92); 2Dos pélvica cíclica: perda de 12 (n = 92); 3Dispareunia: perda de 13 (n = 91); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 11 (n = 93); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 11 (n = 93); 6Infertilidade: perda de 14 (n = 90). Nota 3: Amostras de Fluido Peritoneal – Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 35 (n = 69); 2Dos pélvica cíclica: perda de 35 (n = 69); 3Dispareunia: perda de 36 (n = 68); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 35 (n = 69); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 35 (n = 69); 6Infertilidade: perda de 36 (n = 68). Nota 4: Amostras de Tecido de Biópsia – Perda de observação: 1Dismenorreia: perda de 16 (n = 88); 2Dos pélvica cíclica: perda de 16 (n = 88); 3Dispareunia: perda de 17 (n = 87); 4Alterações intestinais cíclicas: perda de 15 (n = 89); 5Alterações urinárias cíclicas: perda de 15 (n = 89 ); 6Infertilidade: perda de 17 (n = 87); *Significância estatística quando p < 0,05 *Teste de Chi-quadrado ɸ Teste de Fisher 157 158 APÊNDICE M – Detecção de Mollicutes em amostras de swab endocervical por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose. Nota: Perda de observação: 1ASRM estágio: perda de 27 (n = 71); 2Tipo de EDT: perda de 3 (n = 97) *Significância estatística quando p < 0,05 † Teste de Qui-quadrado ¥ Razão de Verossimilhança ND: Não definida Variáveis Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de swab endocervical M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* ASRM estádio, n (%)1 I e II III e IV 7 (70,0) 30 (49,2) 2,41 [0,57; 10,20] 0,222† 17 (54,8) 20 (50,0) 1,21 [0,474; 3,11] 0,686 4 (66,7) 33 (50,8) 1,93 [0,33; 11,33] 0,456† 6 (60,0) 31 (50,8) 1,45 [0,37; 5,66] 0,590† 3 (30) 31 (50,8) 14 (45,2) 20 (50,0) 2 (33,3) 32 (49,2) 4 (40,0) 30 (49,2) Tipo de Endom, n (%)2 Sem Endometriose Peritoneal Ovariana Profunda 3 (23,1) 24 (28,6) 1,00 0,884¥ 11 (26,8) 16 (28,6) 1,00 0,977¥ 1 (14,3) 26 (28,9) 1,00 0,305¥ 6 (37,5) 21 (25,9) 1,00 0,851¥ 3 (23,1) 12 (14,3) ND -- 7 (17,1) 8 (14,3) 0,78 [0,22; 2,80] 3 (42,9) 12 (13,3) 0,15 [0,01; 1,63] 2 (12,5) 13 (16,0) 1,86 [0,33; 10,61] 0 (0) 2 (2,4) 1,64 [0,36; 7,32] 1 (2,4) 1 (1,8) 0,68 [0,03; 12,20] 0 (0) 2 (2,2) ND -- 0 (0) 2 (2,5) ND -- 7 (53,8) 46 (54,8) 2,00 [0,35; 11,43] 22 (53,7) 31 (55,4) 0,96 [0,37; 2,48] 3 (42,9) 50 (55,6) 0,64 [0,06; 6,47] 8 (50,0) 45 (55,6) 1,60 [0,49; 5,22] 158 159 APÊNDICE N – Detecção de Mollicutes em amostras de fluido peritoneal por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose. Nota: Perda de observação: 1ASRM estágio: perda de 24 (n = 54) *Significância estatística quando p < 0,05 † Teste de Qui-quadrado ¥ Razão de Verossimilhança ND: Não definida Variáveis Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de Fluido Peritoneal M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* ASRM estádio, n (%)1 I e II III e IV 13 (59,1) 15 (46,9) 1,63 [0,56; 4,90] 0,377† 11 (73,3) 17 (43,6) 3,55 [0,96; 13,16] 0,050 2 (100) 26 (50,0) ND - - 0 (0) 28 (51,9) ND - - 9 (40,9) 17 (53,1) 4 (26,7) 22 (56,4) 0 (0) 26 (50,0) 0 (0) 26 (48,1) Tipo de Endom, n (%) Sem Endometriose Peritoneal Ovariana Profunda 5 (18,5) 19 (37,3) 1,00 0,325¥ 4 (21,1) 20 (33,9) 1,00 0,189¥ 0 (0) 24 (31,6) ND - - 0 (0) 24 (30,8) ND - - 5 (18,5) 5 (9,8) 0,26 [0,05; 1,28] 5 (26,3) 5 (8,5) 0,20 [0,03; 1,03] 1 (50,0) 9 (11,8) 0 (0) 10 (12,8) 0 (0) 2 (3,9) ND -- 1 (5,3) 1 (1,7) 0,20 [0,01; 3,90] 0 (0) 2 (2,6) 0 (0) 2 (2,6) 17 (63,0) 25 (49,0) 0,38 [0,12; 1,23] 9 (47,4) 33 (55,9) 0,73 [1,99; 2,69] 1 (50,0) 41 (53,9) 0 (0) 42 (53,8) 159 160 APÊNDICE O – Detecção de Mollicutes em amostras de tecido de biópsia por meio da PCR em tempo real (qPCR) e sua relação com o estadiamento e tipo de endometriose. Nota: Perda de observação: 1ASRM estágio: perda de 06 (n = 98) *Significância estatística quando p < 0,05 † Teste de Qui-quadrado ¥ Razão de Verossimilhança ɸ Teste de Fisher ND: Não definida Variáveis Distribuição (%) entre qPCR-positivo e negativo por microrganismo para amostras de tecido de biópsia M. genitalium M. hominis U. urealyticum U. parvum qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* qPCR Positivo qPCR Negativo OR IC 95% p* ASRM estádio, n (%)1 I e II III e IV 2 (18,2) 28 (32,2) 0,46 [0,09; 2,31] 0,342† 0 (0) 30 (31,9) 1,06 [1,00; 1,12] 0,309ɸ 0 (0) 30 (30,6) ND - - 0 (0) 30 (30,6) ND - - 9 (81,8) 59 (67,8) 4 (100) 64 (68,1) 0 (0) 68 (69,4) 0 (0) 68 (69,4) Tipo de Endom, n (%)2 Sem Endometriose Peritoneal Ovariana Profunda 2 (18,2) 28 (32,2) 1,00 0,244¥ 0 (0) 30 (31,9) 1,00 - - 0 (0) 30 (30,6) 1,00 - - 0 (0) 30 (30,6) 1,00 - - 3 (27,3) 11 (12,6) 0,26 [0,03; 1,78] 1 (25,0) 13 (13,8) ND - 0 (0) 14 (14,3) ND - 0 (0) 14 (14,3) ND - 1 (9,1) 1 (1,1) 0,07 [0,003; 1,61] 0 (0) 2 (2,1) ND - 0 (0) 2 (2,0) ND - 0 (0) 2 (2,0) ND - 5 (45,5) 47 (54,0) 0,67 [0,12; 3,69] 3 (75,0) 49 (52,1) ND - 0 (0) 52 (53,1) ND - 0 (0) 52 (53,1) ND - 160 161 ANEXO A – Parecer 1170/CEPSH 162 ANEXO B – Parecer AVAP GBC260 163 ANEXO C – Parecer nº 550.484 164 165 ANEXO D – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Universidade de São Paulo Instituto de Ciências Biomédicas TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ESTUDO: Avaliação da participação dos Mollicutes e outros microrganismos de interesse genital na endometriose humana Você está sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado. O documento abaixo contém todas as informações necessárias sobre a pesquisa que estamos fazendo. Sua colaboração neste estudo será de muita importância para nós, mas se desistir a qualquer momento, isso não causará nenhum prejuízo a você. Eu, _________________________________________________________________, pr ofissão _____________________, residente e domiciliado na ___________________________________________________________, portador da Cédula de identidade, RG ___________________________, e inscrito no CPF/MF______________________________ nascido(a) em _____ / _____ /_______ , abaixo assinado(a), concordo de livre e espontânea vontade em participar como voluntário(a) do estudo “Avaliação da participação dos Mollicutes e outros microrganismos de interesse genital na endometriose humana ”. Declaro que obtive tod as as informações necessárias, bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto às dúvidas por mim apresentadas. Estou ciente que: I) O estudo se faz necessário para que se possam descobrir as possíveis causas da doença denominada endometriose a ser estuda da no projeto “Avaliação da participação dos Mollicutes e outros microrganismos de interesse genital na endometriose humana”; II) Serão coletadas amostras de líquido intraperitoneal (fluido na cavidade formada entre as camadas de peritônio que revestem as alça s intestinais) biópsia de lesão do peritônio pélvico (procedimento cirúrgico no qual se colhe uma amostra de tecidos ou células para posterior estudo em laboratório). III) A participação neste projeto não tem objetivo de me submeter a um tratamento, bem como não me acarretará qualquer despesa financeira com relação aos procedimentos médico-clínico-terapêuticos efetuados no estudo; IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboração neste estudo no momento em que desejar, sem necessidade de qualquer explicação; V) A desistência não causará nenhum prejuízo à minha saúde ou bem estar físico. Não virá interferir no atendimento ou tratamento médico; VI) Os resultados obtidos durante este ensaio serão mantidos em sigilo, mas concordo que sejam divulgados em publicações científicas, desde que meus dados pessoais não sejam mencionados; VII) Caso eu desejar, poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados, ao final desta pesquisa. ( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa. ( ) Não desejo conhecer os resultados desta pesquisa. 166 VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado pela Comissão de Ética deste Instituto e pelo responsável por esta pesquisa. Caso minha manifestação seja positiva, poderei retirar essa autorização a qualquer momento sem qualquer prejuízo para mim. ( ) Sim ou ( ) Não IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissão de Ética em Pesquisa com Seres Humanos – ICB/USP -, no Fone 3091.7733 (e-mail: [email protected]) ou (11 3091-7297 [email protected]) para recursos ou reclamações em relação ao presente estudo. X) O sujeito de pesquisa ou seu representante, quando for o caso, deverá rubricar todas as folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE - apondo sua assinatura na última página do referido Termo. XI) O pesquisador responsável deverá da mesma forma, rubricar todas as folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE– apondo sua assinatura na última página do referido Termo. XII) Resolução 196/96 - Estou recebendo uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. São Paulo, de de 20____ ( ) Paciente / ( ) Responsável ........................................................................................... ........ Testemunha 1: _______________________________________________ Nome / RG / Telefone: Testemunha 2: ___________________________________________________ Nome / RG / Telefone: Responsável pelo Projeto: _____________________________________________________ PROF. DR. JORGE TIMENETSKY 167 ANEXO E – Escala Analógica de Dor (EAD) A Escala Visual Analógica da Dor – EAD consiste em auxiliar na aferição da intensidade da dor no paciente, é um instrumento importante para verificarmos a evolução do paciente durante o tratamento e mesmo a cada atendimento, de maneira ma is fidedigna. Também é útil para podermos analisar se o tratamento está sendo efetivo, quais procedimentos têm surtido melhores resultados, assim como se há alguma deficiência no tratamento, de acordo com o grau de melhora ou piora da dor. A EAD pode ser utilizada no início e no final de cada atendimento, registrando o resultado sempre na evolução. Para utilizar a E AD o atendente deve questionar o paciente quanto ao seu grau de dor sendo que 0 significa ausência total de dor e 10 o nível de dor máxima suportável pelo paciente. Dicas sobre como interrogar o paciente:  Você tem dor?  Como você classifica sua dor? (deixe ele falar livremente, faça observações na pasta sobre o que ele falar) Questione-o: a) Se não tiver dor, a classificação é zero. b) Se a dor for moderada, seu nível de referência é cinco. c) Se for intensa, seu nível de referência é dez. OBS.: Procure estabelecer variações de melhora e piora na escala acima tomando cuidado para não sugestionar o paciente. 168 ANEXO F – Questionário de dados clínicos do Setor de Endometriose do Hospital das Clínicas Dados Clínicos da Paciente Esta ficha se trata de algumas questões sobre aspectos de sua vida, principalmente relacionadas à sua saúde. Pedimos, por favor, que tente responder da melhor maneira possível, pois essas informações nos ajudarão a solucionar muitas dúvidas sobre o diagnóstico e o tratamento de doenças, como por exemplo, a Endometriose Data ____/ ____ /____ Médico: _ Registro: Em qual dia de seu ciclo menstrual você estará no dia da cirurgia? OU quando foi a sua ultima menstruação antes da cirurgia? _____________________ ( ) Não sei. ( ) Nenhum – Motivo:_________________ Dados Pessoais: Nome: _ Data de Nascimento: ____/ ____ /____ ( ___ anos) Altura:________ Peso: ________ Raça: ( ) Branca ( ) Negra ( ) Amarela ( ) Parda Estado Civil: ( ) Solteira ( ) Estável – casada ou amasiada ( ) Viúva ( ) Separada Grau de Instrução: ( ) Nenhum ( ) Primeiro Grau ( ) Segundo Grau ( ) Superior Endereço (Rua, Número, Cidade, CEP): ______________________________________. ____________________________________ ________. Telefone para contato: ( ) _ - . ou ( ) _ - . E-mail: __ . 169 Antecedentes: 1) Você tem, ou teve alguma doença na sua vida? (Independente da doença atual) ( ) Não ( ) Sim Se sim, qual (quais)?________________________________ 2) Você realiza atividade física regular(*)? ( ) Não ( ) Sim 3) Você fuma? ( ) Não ( ) Não mais. ( ) Sim, _____ cigarros por dia 4) Você já passou por alguma cirurgia por Endometriose? ( ) Não ( ) Sim Se sim, quantas? ________ 5) Você já passou por alguma outra cirurgia no abdômen? ( ) Não ( ) Sim Se sim, quantas? _____ // E quais? __________ ______________________________________________________ _ 6) Você toma, ou tomou, nos últimos 3 meses, algum dos medicamentos abaixo? ( ) Não ( )Anticoncepcional Oral ( )Zoladex ( )Lupron ( )Mirena ( )Evra ( )Depoprovera ( )Farlutal ( )Dimetrose ( ) Nuvaring ( )Provera ( )Primolut-nor ( )Cerazette ( )Outros: _______________ (*) Exercícios com duração de 30 minutos, com freqüência de no mínimo 3 vezes por semana. 170 7) Você sabe de algum caso de Endometriose na sua família? ( ) Não ( ) Sim Se sim, quem? (grau de parentesco) ____________________ 8) Seu ciclo menstrual é regular? ( ) Não ( ) Sim ____ dias de menstruação // ____ dias de intervalo. 9) Você considera seu fluxo: ( ) Diminuído; ( ) Normal ou ( ) Aumentado? 10) Com quantos anos você menstruou pela primeira vez? ____ anos. 11) Você utiliza, ou utilizou na vida, algum Método Anticoncepcional Prévio? ( ) Não ( ) Comportamental ( ) Perlutan/Mesygina ( ) Diu (simples) ( ) Evra ( ) Camisinha ( ) Depo-provera ( ) Mirena ( ) Pílula ( ) Nuvaring 12) Você já engravidou alguma vez? ( ) Não ( ) Sim Se sim, quantas delas foram: Partos Normais ___ Partos Cesárea____ Abortos____ Gravidez Ectópica_____ 171 A) Você sente cólicas menstruais? ( ) Não ( ) Sim, e não necessita de medicação. [Escala de dor n°___ ] ( ) Sim, e necessita de medicação para alivia-las. [Escala de dor n°___ ] ( ) Sim, e necessita de medicação para alivia-las, no entanto não melhoram. [Escala de dor n°__ ] ( ) Sim, e necessita de medicação, no entanto elas não melhoram e já precisou ir ao Pronto Socorro, ou faltar ao trabalho em decorrência das mesmas. [Escala de dor n°___ ] B) Você sente cólicas que não apresentam relação nenhuma com o seu ciclo menstrual, e que não melhoram mesmo tomando analgésicos? ( ) Não ( ) Sim, e não necessita de medicação. [Escala de dor n°___] ( ) Sim, e necessita de medicação para alivia-las. [Escala de dor n°___] ( ) Sim, e necessita de medicação para alivia-las, no entanto não melhoram. [Escala de dor n°__] ( ) Sim, e necessita de medicação, no entanto elas não melhoram e já precisou ir ao Pronto Socorro, ou faltar ao trabalho em decorrência das mesmas. [ Escala de dor n°___] Quadro Clínico: 1) Se você possui sintomas, cite o que você consideraria o principal deles, e por quanto tempo este a perturba: ______________________ // ____ anos. 2) Baseado na seguinte escala visual analógica de dor: Responda sobre os seguintes sintomas. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sem dor Pior dor existente 172 C) Você sente dor na relação sexual? ( ) Não ( ) Na penetração. ( ) De profundidade (Dor no fundo da vagina). [Escala de dor n°___ ] D) Você sente alterações intestinais relacionadas com a menstruação? ( ) Não ( ) Dor, [Escala de dor n°___ ] ( ) Sangramento ( )Intestino Solto ( )Intestino Preso ( ) Outros: ______________ E) Você sente alterações urinárias relacionadas com a menstruação? ( ) Não ( ) Dor, [Escala de dor n°___ ] ( ) Sangramento ( ) Aumento da freqüência ( ) Outros, _______________ 3) Em relação a sua fertilidade, você: ( ) Nunca conseguiu engravidar. ( ) Possui filhos, mas atualmente não consegue engravidar. ( ) Não tenta engravidar (não tem vida sexual ativa, usa método anticoncepcional, etc.) ( ) Já possui filhos, e não deseja mais engravidar. 4) Se não consegue engravidar, isso se deve à: ( ) Motivo desconhecido ( ) Fator Masculino ( ) Tubário ( ) Insuficiência Ovariana ( ) Outros Ovulatórios ( ) Outros: _____ 5) Você já fez algum tratamento para engravidar? ( ) Não ( ) Indução Ovulatória ( ) Inseminação Intra-uterina ( ) Fertilização In Vitro